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1. Eletroporação
- Colocar 400 μl de suspensão celular numa cubeta pré-arrefecida e adicionar 20 μg de proteína selecionada à cubeta (50 μg/ml).
- Agite a cubeta suavemente ~ 10 vezes para misturar sem danificar as células. nota: A cubeta também pode ser invertida várias vezes para se misturar completamente, mas não pipete para cima e para baixo ou vórtice para evitar danificar as células.
- Seque a parte externa da cubeta com uma toalha de papel ou outro limpador para evitar arco elétrico no eletroporador.
- Amostra de eletroporato a 0,3 kV por 1,5-1,7 mseg. Nota: Isso foi típico para este estudo.
- Imediatamente após a eletroporação, agite a cubeta suavemente ~ 10 vezes para misturar bem.
2. Revestimento de células
- Armazene a cubeta com células eletroporadas no gelo até que esteja pronta para colocá-la nas placas de recuperação.
- Para a maioria das análises a jusante, lave as células 1x com NGM pré-aquecido para remover a proteína efetora estranha.
- Remover as células para análise e suspender em 3-5 ml de NGM.
- Células de pellets por centrifugação a 900 x g por 4 min.
- Ressuspenda em um volume adequado de NGM para o tamanho desejado da placa (por exemplo, 2 ml para um prato de 35 mm).
- Remova a quantidade apropriada de células para análise a jusante.
- Exemplo 1: Placa em pratos de fundo de vidro para análise de microscopia.
- Exemplo 2: Placa em plástico de cultura de células para análise de proteínas, como purificações de afinidade.
- Permita que as células se recuperem em placas equilibradas em uma atmosfera umidificada de 95% de ar / 5% de CO2 a 37 ° C por pelo menos 4 horas.
3. Análise de Microscopia
- Coloração de fixação/imunofluorescência
- Lave as células 1x com PBS estéril após um período de recuperação de 4 horas.
- Fixe as células em metanol 100% por 2 min em temperatura ambiente. Utilizar metanol suficiente para cobrir completamente as células (por exemplo, 2 ml para uma placa de 35 mm).
- Lave 3x com PBS estéril.
- Permeabilize as células com 0,4% de Triton X-100 em PBS por 15 min. Por exemplo, use 1 ml para uma placa de 35 mm de diâmetro.
- Ajuste o comprimento de permeabilização e a força do Triton X-100 de acordo com o epítopo e a localização da proteína alvo. nota: Os melhores resultados precisarão ser determinados empiricamente para cada alvo, no entanto, as condições acima devem ser adequadas para a maioria dos alvos citosólicos.
- Bloqueio com albumina de soro bovino (BSA) a 5% em PBS por 1 hora em RT. Por exemplo, use 1 ml para uma placa de 35 mm de diâmetro.
- Lave 3x com PBS.
- Incubar o anticorpo primário em solução de ligação de anticorpos (0,1% Triton X-100 e 1% BSA em PBS) durante a noite a 4 °C com um balanço suave. Por exemplo, use 0,5 ml para uma placa de 35 mm de diâmetro.
- Siga as recomendações do fabricante para diluição de anticorpos. nota: Por exemplo, o anticorpo de marcação de peptídeo de ligação à estreptavidina (SBP-tag) foi usado na diluição de 1:1.000, enquanto o anticorpo PKN1 foi usado na diluição de 1:200.
- Lave 4x com PBS.
- Incubar com anticorpo secundário conjugado fluorescentemente apropriado em solução de ligação de anticorpos por 1 hora à temperatura ambiente, protegido da luz.
- Por exemplo, use Alexa 488 ou Alexa 647 por 1 hora em temperatura ambiente.
- Siga as recomendações do fabricante para diluição de anticorpos. (por exemplo, cerca de 1:1.000 para este estudo).
- Adicione outras manchas conforme necessário, por exemplo, 5 μM de aglutinina de gérmen de trigo (WGA) conjugada a Alexa 647 ou DAPI de acordo com a recomendação do fabricante, por 1 hora em temperatura ambiente.
- Lave 5x com PBS e armazene a 4 °C, protegido da luz até que esteja pronto para a imagem.