Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Cultivo de Malassezia em condições de laboratório
NOTA: Armazene todos os reagentes e meios usados para este protocolo em temperatura ambiente (RT, 20 – 25 °C), salvo indicação em contrário, pois a temperatura mais baixa pode inibir o crescimento de fungos.
- Preparar o meio Dixon (mDixon) modificado com líquido para o crescimento de Malassezia. Para preparar 500 mL de meio mDixon líquido, dissolva 18 g de extrato de malte, 10 g de bile de boi desidratada, 5 mL de Tween-40, 3 g de peptona, 1 mL de glicerol e 1 mL de ácido oleico em 500 mL de H2O destilado (dH2O). Ajuste o meio para pH 6 com HCl e autoclave. Armazene o meio em RT.
- Prepare as placas de ágar mDixon adicionando 7,5 g de ágar a 500 mL de meio mDixon antes da autoclavagem. Resfrie lentamente o ágar mDixon após a autoclavagem usando uma barra de direção e uma placa de aquecimento magnética para evitar a solidificação parcial do meio durante o resfriamento.
- Assim que o ágar esfriar a 50 – 60 °C, dispense o líquido em placas de Petri em uma capela de fluxo laminar e deixe-as secar em RT durante a noite.
nota: As placas de ágar podem ser armazenadas a 4 °C por várias semanas quando embrulhadas e mantidas de cabeça para baixo para evitar a evaporação.
- Obter isolados de Malassezia e reviver estoques liofilizados de Malassezia de acordo com as instruções obtidas pelo provedor.
- Inocular 10 ml de meio mDixon líquido num balão Erlenmeyer estéril de 100 ml com a suspensão de Malassezia revivida, de acordo com as instruções obtidas pelo médico. Incubar a cultura numa incubadora agitável a 30 °C e 180 rpm.
- Inspecione o crescimento da cultura de Malassezia regularmente, verificando a aparência de cor creme e turbidez. A cinética de crescimento depende da espécie e da cepa de Malassezia e pode ser particularmente lenta quando Malassezia é recém-revivida de um estoque liofilizado. (Figura 1A).
- Prepare os estoques de glicerol misturando 3 partes da cultura de Malassezia densamente cultivada em meio mDixon com 1 parte de glicerol estéril a 99%. Alicotar a mistura de Malassezia e glicerol em tubos esterilizados com tampa de rosca e conservar a -80 °C.
- Para a propagação in vitro, colocar Malassezia em placas da cultura líquida em mDixon ou da reserva de glicerol congelada para uma placa de ágar-ágar mDixon (trazida à RT a partir de 4 °C) utilizando um circuito de inoculação.
nota: Transferir placas de ágar-mDixon para RT a partir de 4 °C antes da utilização, uma vez que o ágar-ágar mDixon frio inibe o crescimento de fungos.
- Incubar a(s) placa(s) de ágar com Malassezia de cabeça para baixo em uma incubadora aN (sem agitação) a 30 °C. Inspecionar regularmente o crescimento das colônias de Malassezia.
NOTA: As colônias de Malassezia em placas de ágar mDixon aparecem dentro de 3 a 5 dias e são de cor creme opaca e lisa com elevação convexa (Figura 1B).
- Armazene as colônias de Malassezia em placas de ágar mDixon em RT por ~ 2 semanas. Em seguida, preparar uma nova placa de ágar-ágar mDixon retirando a Malassezia da reserva de glicerol congelada, conforme descrito no ponto 1.7.
2. Preparação do inóculo para infecção experimental por Malassezia em camundongos
- Inocular 10 ml de meio mDixon líquido num balão Erlenmeyer estéril de 100 ml com 3 a 5 colónias individuais de Malassezia a partir de uma placa de ágar mDixon (ver passo 1, figura 1B).
- Incubar a cultura de Malassezia por ~ 48 a 96 h a 30 °C e 180 rpm até que a cultura fique de cor creme e turva (Figura 1A).
nota: O tempo necessário para o crescimento de Malassezia depende da espécie e cepa de Malassezia e da quantidade de fungo usada para inoculação.
- Transfira 2 mL da cultura de Malassezia para um tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL e centrifugue por 1 min a 10.000 x g.
- Descarte o sobrenadante e lave o pellet suspendendo-o em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Centrifugue novamente por 1 min a 10.000 x g.
- Após a lavagem, suspender o sedimento em 1 ml de PBS por pipetagem vigorosa e medir a densidade óptica da solução a 600 nm (ODA600) com um espectrómetro. Diluir a suspensão de Malassezia 20 – 50 x com PBS para a medição do diâmetro externo para garantir que a leitura esteja entre 0,1 e 1,
nota: A densidade de uma cultura de 3 dias de Malassezia geralmente varia entre 15 e 30 ODA600, dependendo da espécie e cepa de Malassezia e do número de células de levedura usadas para inoculação da cultura (etapa 2.1). Malassezia tende a formar agregados, portanto, é necessária uma pipetagem vigorosa para garantir a homogeneidade da suspensão.
- Alíquota de um volume da suspensão de Malassezia em PBS que corresponde a uma densidade de 4 ODA600 em um tubo estéril de 2 mL. Prepare 1 tubo por animal a ser infectado.
- Centrifugar os tubos contendo Malassezia durante 1 min a 10 000 x g.
- Rejeitar o sobrenadante e suspender o pellet de Malassezia em 200 μl de azeite autóctone (correspondente a 2 células de leveduraOD A600/100 μl de azeite).
nota: O azeite de oliva foi considerado um bom veículo para a infecção epicutânea por Malassezia, já que Malassezia é uma levedura lipofílica e dependente de lipídios. O azeite de oliva é melhor absorvido pela pele do que o PBS. No entanto, esteja ciente de que não é fácil suspender a Malassezia no azeite. Melhorar a suspensão de Malassezia/azeite por vórtice. Mantenha a suspensão em RT até que seja usada para infecção.
- Prepare tubos apenas com azeite de oliva para infecção simulada de animais de controle.
3. Infectando camundongos com Malassezia
- Encomende camundongos C57BL/6 fêmeas com idade de 6 a 8 semanas e permita que eles se aclimatem na instalação experimental de animais por pelo menos uma semana. Calcule para 3 a 5 camundongos por grupo, incluindo um grupo de controle não infectado.
- Prepare um coquetel anestésico estéril contendo 1,3 mg/mL de xilazina e 6,5 mg/mL de cetamina em PBS. 5 mL do coquetel anestésico são suficientes para anestesiar 20 animais. Ajuste o volume do coquetel de acordo com o número de animais a serem anestesiados.
- Anestesiar os animais injetando 10 μL/g de peso corporal de coquetel anestésico por via intraperitoneal (correspondendo a 65 mg de cetamina e 13 mg de xilazina por kg de peso corporal) e colocar os animais anestesiados em uma almofada de aquecimento a 37 °C.
nota: Na dose indicada, os animais geralmente permanecem anestesiados por ~ 30 - 60 min.
- Verifique os reflexos beliscando o pé traseiro com uma pinça para garantir que os animais estejam totalmente anestesiados.
- Aplique um creme para os olhos nos olhos para evitar a desidratação durante a anestesia.
- Opcionalmente, meça a espessura da orelha de ambas as orelhas usando um paquímetro (faixa de 0 a 5 mm). Meça duas áreas diferentes de cada orelha e calcule a espessura média da orelha por orelha.
nota: A medição da espessura da orelha é opcional e depende da questão de pesquisa. No entanto, se a espessura da orelha for usada como leitura da inflamação da pele, é necessário medir a espessura basal da orelha antes da infecção. (consulte a Etapa 4).
- Opcionalmente, rompa a barreira epidérmica da pele dorsal da orelha por meio de uma leve remoção de fita: aplique manualmente um pequeno pedaço de fita adesiva na pele e remova-a novamente. Repita por 5 rodadas consecutivas usando um novo pedaço de fita adesiva para cada rodada.
NOTA: Malassezia induz uma inflamação cutânea mais pronunciada na pele com barreira rompida em comparação com a pele não perturbada (Figura 2A).
- Aplique topicamente 100 μL (2 ODA600) da suspensão de Malassezia / azeite de oliva no lado dorsal de cada orelha usando uma pipeta estéril. Incluir um grupo controle de animais tratados apenas com azeite (grupo controle tratado com veículo).
nota: Agitar vigorosamente a suspensão de Malassezia/azeite para garantir uma suspensão homogénea de Malassezia imediatamente antes da aplicação.
- Deixe os animais anestesiados na almofada de aquecimento para evitar hipotermia até que apresentem sinais de recuperação (movimento do bigode, aumento da frequência respiratória, etc.).
- Injete 200 μL de solução estéril e pré-aquecida de glicose a 2% por via subcutânea na dobra nucal para apoiar seu metabolismo e reidratação.
nota: Para preparar uma solução estéril de glicose a 2%, dissolva 1 mg de glicose em 50 mL de PBS e filtre-a usando um filtro de 0,2 μm. A solução pode ser conservada a 4 °C.
- Transfira os animais de volta para a gaiola.
4. Análise da inflamação da pele induzida por Malassezia
NOTA: Este procedimento descreve a análise do inchaço da orelha induzido por Malassezia durante a infecção, que serve como parâmetro de inflamação da pele. Um pré-requisito para analisar o inchaço da orelha induzido por fungos é medir a espessura basal da orelha antes da remoção da fita e/ou infecção (Etapa 3.5).
- Prepare a câmara de isoflurano para anestesia de curto prazo de animais infectados e controle por Malassezia.
- Transfira um animal de cada vez para a câmara e aguarde que o animal esteja totalmente anestesiado.
nota: Os sinais de anestesia adequada incluem relaxamento completo do corpo, bem como respiração lenta e pesada (flanco). Monitore cuidadosamente a anestesia, pois a exposição prolongada ao isoflurano pode ser fatal.
- Retire o animal da câmara e coloque-o sobre um lenço de papel.
- Meça a espessura da(s) orelha(s) usando um paquímetro (faixa de 0 a 5 mm). Meça duas áreas diferentes de cada orelha e calcule a espessura média por orelha (consulte a etapa 3.5).
- Transfira o animal de volta para a gaiola.
nota: A anestesia com isoflurano é de curta duração e os animais se recuperam em ~ 30 s após a remoção da câmara de isoflurano.
- Calcule o aumento na espessura da orelha subtraindo a espessura média da orelha basal, medida antes da remoção da fita e/ou infecção, da espessura média da orelha medida em cada ponto de tempo após a infecção.
- Representar graficamente os valores calculados como o aumento da espessura da espiga ou, em alternativa, como a espessura total da espiga ao longo do tempo para cada animal ou grupo de animais (figura 2B).
5. Análise da carga fúngica na pele infectada
- Prepare um tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL para cada espiga a ser colhida, contendo 0,5 mL de P40 (NP40) estéril a 0,05% de nonidet (NP40) em dH2O e uma esfera de aço autoclavada (5 mm de diâmetro).
- Pese os tubos usando uma balança de precisão e anote o peso preciso.
- Eutanasiar os camundongos por asfixia por CO2.
- Remova a(s) orelha(s) na base e transfira para o tubo contendo 0,5 mL de NP40 estéril a 0,05% em dH2O, conforme descrito nas etapas 5.1 - 5.2.
- Pesar o tubo que contém o tecido da orelha e calcular o peso real de cada amostra subtraindo o peso do tubo sem o órgão do peso do tubo com o órgão.
- Homogeneizar o tecido da orelha por 6 min a 25 Hz usando um homogeneizador de tecidos. Certifique-se de que o tecido esteja bem homogeneizado.
- Colocar 100 μL de cada amostra (correspondente a 1/5 de cada homogeneizado, fator de diluição = 5) em placas de ágar mDixon e incubar as placas de cabeça para baixo em uma incubadora a 30 °C.
nota: A quantidade de homogeneizado deve ser ajustada de acordo com a carga fúngica esperada. Certifique-se de homogeneizar o suficiente para obter pelo menos 10 e não mais que 250 colônias por placa para permitir uma enumeração fácil. Opcionalmente, coloque várias placas por amostra com diferentes diluições de homogeneizado.
- Inspecione o crescimento das colônias de Malassezia regularmente.
nota: As colônias geralmente se tornam visíveis após 2 a 3 dias. O tempo necessário para o crescimento das colônias de Malassezia depende da espécie e da cepa de Malassezia.
- Conte as colônias por placa.
- Calcule o número de unidades formadoras de colônias, UFC/g de tecido, usando a seguinte fórmula:
UFC/g de tecido = (número de colônias/placa) x (fator de diluição) / (peso da amostra de pele em g).
nota: O limite mínimo de detecção aproximado pode ser avaliado usando a seguinte fórmula: limite mínimo de detecção = (1 colônia/placa) x (fator de diluição) / (peso médio de todas as amostras de pele em g).
- As cargas fúngicas são geralmente plotadas em uma escala logarítmica (Figura 2C).
