Um modelo de infecção de macrófagos totalmente diferenciado de células derivadas de monócitos com Mycobacterium tuberculosis

Resumo

Fonte: Mily, A., et al. Polarização de células derivadas de monócitos humanos M1 e M2 e análise com citometria de fluxo na infecção por Mycobacterium tuberculosis. J. Vis.(2020).

Este vídeo demonstra um método para estudar as respostas à infecção por Mycobacterium tuberculosis em macrófagos humanos derivados de monócitos polarizados M1 e M2. O uso da citometria de fluxo permite o estudo de uma variedade de marcadores de superfície associados a populações de macrófagos infectados e não infectados.

Protocolo

1. Infecção por Mtb de células derivadas de monócitos

NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas em uma instalação BSL-3.

1. Ressuspenda o pellet de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) em meio RPMI sem soro em um novo tubo estéril de 50 mL e ajuste a concentração bacteriana final para aproximadamente 5 x 10⁶ UFC / mL.
2. Remover o meio de cultura celular da(s) placa(s) de 6 poços que contém células derivadas de monócitos. Adicione 1 mL de meio RPMI sem soro a cada poço. Adicionar 1 mL de suspensão bacteriana por poço para obter uma multiplicidade de infecção (MOI) 5:1, ou seja, 5 x 10⁶ UFC por 10⁶ macrófagos em 2 mL/poço e incubar as placas por 4 h a 37°C e 5% de CO₂.
3. Após a infecção, lave as células 3 vezes com 1 mL de tampão de lavagem estéril para remover bactérias extracelulares. Incline a placa e remova cuidadosamente todo o tampão de lavagem dos cantos. Ressuspenda as células derivadas de monócitos infectadas com Mtb em 2 mL de meio completo RPMI sem antibióticos e prossiga para a coloração por citometria de fluxo ou incube as células por mais 24 h (ou outros pontos de tempo) antes da citometria de fluxo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Corrediças de câmara de 8 poços	Lab-Tek	154534
RPMI 1640	Corporação de Tecnologias da Vida	SH30096.01
IFN-γ	Peprotech	300-02
Na-piruvato	Ciências da Vida da GE Healthcare	SH300239.01
L-Glutamina	Ciências da Vida da GE Healthcare	SH30034.01
Placas de fundo plano Falcon de 6 poços	Ciências da Vida da Corning	353046
Soro fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
GM-CSF	Peprotech	300-03