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1. Infecção por Mtb de células derivadas de monócitos
NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas em uma instalação BSL-3.
- Ressuspenda o pellet de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) em meio RPMI sem soro em um novo tubo estéril de 50 mL e ajuste a concentração bacteriana final para aproximadamente 5 x 106 UFC / mL.
- Remover o meio de cultura celular da(s) placa(s) de 6 poços que contém células derivadas de monócitos. Adicione 1 mL de meio RPMI sem soro a cada poço. Adicionar 1 mL de suspensão bacteriana por poço para obter uma multiplicidade de infecção (MOI) 5:1, ou seja, 5 x 106 UFC por 106 macrófagos em 2 mL/poço e incubar as placas por 4 h a 37°C e 5% de CO2.
- Após a infecção, lave as células 3 vezes com 1 mL de tampão de lavagem estéril para remover bactérias extracelulares. Incline a placa e remova cuidadosamente todo o tampão de lavagem dos cantos. Ressuspenda as células derivadas de monócitos infectadas com Mtb em 2 mL de meio completo RPMI sem antibióticos e prossiga para a coloração por citometria de fluxo ou incube as células por mais 24 h (ou outros pontos de tempo) antes da citometria de fluxo.