Um ensaio para estudar o papel da vitronectina na adesão bacteriana às células epiteliais do hospedeiro

Resumo

Fonte: Singh, B. et al., Ensaios para estudar o papel da vitronectina na adesão bacteriana e resistência sérica. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, demonstramos um ensaio para estudar o papel da vitronectina na adesão de Haemophilus influenzae às células epiteliais do hospedeiro.

Protocolo

1. Estudo da adesão dependente de Vn de bactérias a células epiteliais

1. Cultura de células A549 (células epiteliais alveolares tipo II) em frasco de cultura de^{tecidos 2} de 75 cm com meio F12 suplementado com 10% (vol/vol) de soro fetal de bezerro (FCS) (meio completo) e 5 μg/mL de gentamicina. Incubar o frasco em uma incubadora com 5% de CO₂ a 37 °C por 3 dias até 80% de confluência (a confluência pode ser estimada visualizando a cobertura da superfície pelas células usando um microscópio invertido). As quatro etapas a seguir descrevem como preparar as células epiteliais para o ensaio.
   1. Lavar a monocamada de células no balão duas vezes com 20 ml de PBS por agitação suave. Para separar as células da superfície do frasco, adicione 2 ml de solução enzimática de descolamento celular e incube o frasco durante 5 minutos a 37 °C. Bata no balão com a palma da mão para separar todas as células da superfície de plástico. Pipete para cima e para baixo algumas vezes para dispersar os aglomerados de células.
   2. Adicione 18 mL de meio F12 completo ao frasco e transfira toda a suspensão celular para um tubo Falcon estéril de 50 mL. Centrifugar a suspensão celular durante 5 min a 200 x g em RT e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 10 mL de meio F12 completo.
   3. Remova 10 μL da suspensão celular e coloque-a em um tubo Eppendorf, em seguida, adicione 90 μL de solução de azul de tripano. Carregue a amostra em um hemocitômetro (profundidade de 0,1 mm) após colocar a lamínula.
   4. Conte todas as células viáveis nas áreas A, B, C e D (cada campo consiste em 16 quadrados e cada quadrado tem uma área de 0,0025 mm²) e, em seguida, calcule o número médio de células ([A+B+C+D]/4). Calcule o número de células por mililitro usando a seguinte equação:
      Células viáveis/mL = contagem média de células × 10⁴ × fator de diluição.
      nota: Aqui, o fator de diluição é 10.
   5. Diluir a suspensão celular para 5,0 x 10³ células/ml utilizando um meio completo contendo 5 μg/ml de gentamicina. Dispense 500 μL de suspensão celular em cada poço de uma placa de cultura de células de 24 poços. Incubar a placa a 37 °C em CO₂ a 5% até que as células estejam 90% confluentes.
2. Antes da infecção bacteriana, remova o meio dos alvéolos e adicione o meio F12 (sem FCS) e incube durante a noite a 37 ° C.
3. Lavar a monocamada de células três vezes com 500 μl de PBS em RT. Colocar a placa sobre gelo e adicionar 100 μl de meio F12 pré-arrefecido contendo 10 μg/ml de Vn. Incubar a placa a 4 °C durante 1 h. Para poços de controle, adicione apenas meio F12.
4. Após a incubação, rejeitar a solução pipetando e lavar a camada celular duas vezes com 1 ml de PBS em RT.
5. Cultura de isolados clínicos de Hif em meio de infusão cérebro-coração (BHI) suplementado com 10 μg/mL de NAD e hemina a 37 °C com agitação a 200 rpm. Use o meio Luria-Bertani para cultivar E. coli. Colha Hif na fase intermediária (OD600 = 0,3) e ressuspenda as bactérias em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2, contendo 1% (p / v) de albumina de soro bovino (BSA) (tampão de bloqueio; PBS-BSA). Ajuste a suspensão para 10⁹ UFC/mL. Ressuspender uma cultura de Hif M10 recém-cultivado em meio F12 (2×10⁸ UFC/ml). Adicionar 100 μL desta suspensão bacteriana a cada poço e incubar a placa durante 2 h a 37 °C.
   nota: Cada poço contém aproximadamente 2 x 10⁵ células A549. Para infecção, foram adicionadas 2 x 10⁷ UFC bacterianas, correspondendo a uma multiplicidade de infecção de 100.
6. Remova o meio pipetando e lave as células epiteliais A549 três vezes com PBS. Adicionar 50 μL/poço de solução de descolamento celular e incubar a placa durante 5 min a 37 °C.
7. Em seguida, adicione 50 μL de meio completo F12 por poço para interromper a reação enzimática. Transfira as células epiteliais (≈100 μL [ou seja, todo o volume]) de cada poço para um tubo de vidro de 6 mL contendo quatro esferas de vidro. Lise as células em RT por vórtice por 2 min.
8. Dilua 10 μL do lisado celular 100 vezes adicionando 10 μL de lisado a 990 μL de meio F12. Colocar 10 μL da amostra diluída em uma placa de ágar chocolate.
9. Incubar o prato de ágar-chocolate a 37 °C durante a noite e depois contar as colónias. Cada colônia representa uma UFC.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL	Falcão BD	Nº 60819-138	12 × estilo 75 mm
5% CO2 incubadora fornecida	Thermo Científico	BBD6220
Tubo de poliestireno de fundo redondo de 6 mL	VWR	89000-478	12 × estilo 75 mm com tampa
Placas de 24 poços	Falcão BD	08-772-1H	Grau de cultura celular
75 cm2 balão de cultura de tecidos	Falcão BD	BD353136	Exalada
A549 Linha celular humana	Sigma-Aldrich	86012804-1VL
Enzima de descolamento celular (Accutase)	Sigma-Aldrich	A6964-500ML	Grau de cultura celular
Albuminas de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	Adequado para cultura de células
F12 médio	Sigma-Aldrich	D6421	Grau de cultura celular
Soro fetal de bezerro (FCS)	Sigma-Aldrich	12003C	Adequado para cultura de células
Hemocitômetro	Marienfeld	Nº 640210
Balão de cultura de tecidos	Falcão BD	3175167	75 cm2
Vitronectina (Vn) do plasma humano	Sigma-Aldrich	Rolamento V8379-50UG	Grau de cultura celular