Determinando o papel da vitronectina na resistência bacteriana à atividade bactericida do soro humano

Resumo

Fonte: Singh, B. et al., Ensaios para estudar o papel da vitronectina na adesão bacteriana e resistência sérica.J. Vis. Exp.(2018)

Este vídeo demonstra o papel da vitronectina, uma glicoproteína sérica humana, na resistência bacteriana. Os anticorpos no soro interagem com as proteínas da superfície bacteriana, ativando as proteínas do complemento e formando o complexo de ataque à membrana, causando lise celular bacteriana. A ligação da vitronectina à proteína da membrana bacteriana impede a formação do complexo de ataque à membrana, resultando na sobrevivência bacteriana.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Análise da resistência dependente de Vn à atividade bactericida do soro humano

1. Compre soro humano normal (NHS) de uma fonte comercial. Prepare vitronectina ou soro depletado de Vn (VDS). Reabasteça o VDS com 180 nM Vn, o que equivale ao Vn presente no NHS.
2. Preparar o soro inativado pelo calor (SIH) aquecendo o NHS a 56 °C por 30 minutos para inativar as proteínas do complemento.
   nota: A concentração sérica ótima (5%) e o tempo de incubação (15 min) para o ensaio foram determinados empiricamente para Haemophilus influenzae tipo f (Hif); Esses parâmetros podem variar para outros patógenos bacterianos.
3. Cultura de bactérias (neste caso, Hif M10 e o mutante Hif M10Δlph) até a fase intermediária (OD₆₀₀ = 0,3). Bactérias pellets por centrifugação a 3.500 x g por 10 min.
4. Ressuspenda o pellet bacteriano com 1 volume de gelatina de dextrose Tampão veronal (DGVB⁺⁺; pH 7,3) contendo 2,5% (p / v) de glicose, 2 mM de cloreto de magnésio, MgCl₂, 0,15 mM de cloreto de cálcio, CaCl₂ e 0,1% (peso / vol) de gelatina.
5. Adicione 1,5 x 10³ unidades formadoras de colônias (UFC) de bactérias a 100 μL de DGVB⁺⁺ contendo 5% de soro (NHS, HIS, VDS ou VDS + 180 nM Vn). Incubar a amostra a 37 °C durante 15 minutos, agitando a 300 rpm.
6. Retirar uma alíquota de 10 μL da mistura de reacção a 0 min (amostra T₀) e 15 min (amostra T_t) e colocar em ágar chocolate. Incubar a placa a 37 °C durante a noite.
7. Após a incubação, conte as colônias que aparecem na placa. Calcular a percentagem de bactérias mortas utilizando a seguinte equação: (unidade formadora de colónias ou UFC em T_t)/(UFC em T₀) × 100.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de poliestireno de fundo redondo de 6 mL	VWR	89000-478	12 × estilo 75 mm com tampa
Soro humano normal (NHS)	Complement Technology, Inc.	Nhs	Soro humano agrupado
Cloreto de cálcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G
glicose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
gelatina	Sigma-Aldrich	G9391	Adequado para cultura de células
Hemocitômetro	Marienfeld	Nº 640210
Cloreto de magnésio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266-1KG
Vitronectina (Vn) do plasma humano	Sigma-Aldrich	Rolamento V8379-50UG	Grau de cultura celular
shaker	Stuart Científico	STR6	Agitador de plataforma