Um modelo de infecção da mucosa cervical humana para estudar a patogênese do HIV em condições ex vivo

Resumo

Fonte: Introini, A., et al., Infecção Ex Vivo de Tecido Linfóide Humano e Mucosa Genital Feminina com Vírus da Imunodeficiência Humana 1 e Histocultura. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra a infecção ex vivo do tecido da mucosa uterina humana com o vírus da imunodeficiência humana tipo 1, HIV-1, e sua manutenção em cima de esponjas de gelatina na interface ar-líquido. Este método permite o monitoramento da replicação e patogênese do HIV-1 nos tecidos humanos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Dissecção e Infecção da Mucosa Cervical Uterina

NOTA: Para obter os melhores resultados, os explantes de mucosas cervicais devem ser processados e infectados o mais rápido possível após a cirurgia, de preferência no mesmo dia da cirurgia. Alternativamente, as amostras podem ser armazenadas submersas em CMT (meios de cultura suplementados com antibióticos) a 4 ° C durante a noite e infectadas imediatamente após a dissecção.

1. Dê tempo suficiente ao CM para atingir o RT ou coloque-o em banho-maria pré-aquecido a 37 ° C. Complemente o CM com solução antibiótica (CMT) antes de usar. Descarte qualquer sobra de solução antibiótica. Despeje a solução de etanol a 70% em um recipiente limpo para embeber a pinça e o bisturi sempre que necessário durante o procedimento de dissecção. Limpe as ferramentas e troque a lâmina do bisturi entre as dissecações de amostras de vários doadores.
2. Usando uma pinça estéril, transfira a amostra do recipiente de transporte para uma placa de Petri de 100 mm contendo 10–20 mL de CMT.
3. Use a tampa da placa de Petri como uma superfície de corte para dissecar o tecido. Segurando o tecido suavemente com uma pinça, separe a mucosa da ectocérvice e/ou endocérvice do tecido estromal e muscular inferior (submucosa) com um bisturi e uma lâmina para obter tiras de mucosa.
   nota: Ao trabalhar em um pedaço de tecido, é importante manter o resto do tecido submerso em um meio para evitar a dessecação do tecido.
4. Corte a mucosa em tiras de 2 mm de largura e remova e descarte o máximo de submucosa possível, deixando apenas uma camada de tecido de 2 mm de espessura. Corte as tiras em blocos de 2 mm de espessura. Isso deve resultar em explantes de tecido de aproximadamente 8 mm³.
   Cuidado: O manuseio de ferramentas afiadas para dissecar amostras humanas aumenta o risco de ferimentos e contaminação. O operador deve considerar o uso de luvas de metal, malha e resistentes a cortes como proteção adicional.
5. Transfira os explantes de tecido para uma nova placa de Petri de 100 mm contendo 10 a 20 mL de CMT para evitar a dessecação do tecido durante a dissecção. No final da dissecção, gire a placa para randomizar a distribuição do explante.
6. Com pinça estéril, transfira os explantes para o(s) tubo(s) cônico(s) estéril(is) de 1,5 mL (máximo de 16 explantes por tubo). Remova qualquer meio no tubo usando uma pipeta.
7. Descongele a preparação do HIV-1 em banho-maria a 37 °C. Se necessário, dilua o estoque de vírus com CM. Transfira o vírus para o(s) tubo(s) que contém os explantes. Descarte qualquer preparação de vírus residual.
   nota: O estoque de vírus deve ser diluído de modo que o inóculo selecionado esteja contido em um volume mínimo de 0,5 mL (Tabela 1). Para reduzir a variabilidade dos resultados entre experiências independentes, deve ser utilizada a mesma preparação de vírus para um estudo completo (Tabela de Materiais).
8. Transfira os tubos para um termoagitador e incube por 2 h a 37°C balançando a 300 rpm. Inverta suavemente os tubos algumas vezes a cada 30–60 min.
   Nota: Para uma infecção eficiente, é fundamental usar o tempo mínimo necessário entre o descongelamento da preparação do HIV-1 e a transferência dos tubos a 37 °C.
9. Encha uma placa de 6 poços com 3-4 mL por poço de solução salina tampão fosfato estéril (PBS). No final da incubação com HIV-1, descarte toda a preparação do vírus no(s) tubo(s) em um recipiente com uma solução desinfetante usando uma pipeta. Transfira os explantes para a placa de 6 poços contendo PBS usando uma pinça.
10. Deixe os explantes descansarem em PBS por 1 min em RT e, em seguida, lave-os pipetando suavemente para cima e para baixo o PBS no poço 2-3 vezes. Descarte o PBS em um recipiente com uma solução desinfetante usando uma pipeta. Adicione 3-4 mL de novo PBS a cada poço. Repita mais duas vezes para um total de três lavagens. Descarte o PBS antes de transferir os explantes para as esponjas para evitar a dessecação do tecido.
    nota: Os explantes da mucosa cervical e, em particular, da endocérvix, liberam grandes quantidades de muco durante a infecção. É fundamental lavar e remover o máximo de muco possível, pois a retenção inespecífica nos explantes e a subsequente liberação do vírus no sobrenadante da cultura podem mascarar a replicação do vírus.
11. Usando uma pinça, transfira de 5 a 8 explantes em cima de cada esponja de gelatina em uma placa de 12 poços. Retorne a placa para a incubadora.
12. Descarte todos os resíduos biológicos em recipientes opostos de acordo com os regulamentos do instituto sobre o manuseio de produtos biológicos perigosos e a avaliação de risco específica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gelfoam 12-7 mm Esponja de gelatina absorvível	Pfizer	NDC: 0009-0315-08	Gelfoam e Spongostan têm um desempenho igualmente bom na histocutura do tecido tonsilar e cervical.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Esponja de gelatina hemostática absorvível	Ferrosan Dispositivos Médicos	MS0002	Gelfoam e Spongostan têm um desempenho igualmente bom na histocutura do tecido tonsilar e cervical.
RPMI 1640 com vermelho de fenol e glutamina	ThermoFisher Scientific	21875034	Para RPMI1640 adicionar aminoácidos não essenciais MEM, piruvato de sódio, gentamicina, anfotericina B e FBS 15% (v/v) para fazer meio de cultura (CM).
Solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 sem vermelho de cálcio, magnésio e fenol			Para uso para armazenamento e transporte de amostras cirúrgicas. O PBS pode ser substituído por outra solução isotônica com pH fisiológico. O meio de cultura é melhor para armazenamento durante a noite.
Água estéril para cultura de células
Solução de etanol a 70%
Solução desinfetante para descarte de resíduos biológicos
Pinças ou pinças metálicas estéreis
Tesoura de metal estéril
Espátula de metal de pesagem plana estéril
Bisturis e lâminas estéreis
Placas de cultura de células de 6 poços
Placa de Petri estéril, 100 mm × 20 mm
Preparação viral do HIV-1 livre de células HIV-1BaL	Programa de reagentes da AIDS do NIH	510	O vírus deve ser propagado para gerar um estoque grande o suficiente para realizar vários experimentos. Aliquote vírus suspensão e armazenar a -80 °C. Evite congelamento e descongelamento repetidos.
Preparação viral do HIV-1 livre de células HIV-1LAI.04	Programa de reagentes da AIDS do NIH	2522	O vírus deve ser propagado para gerar um estoque grande o suficiente para realizar vários experimentos. Aliquote vírus suspensão e armazenar a -80 °C. Evite congelamento e descongelamento repetidos.
Tubos estéreis de 1,5 e 2 mL com tampa de rosca
Banho-maria regulado para 37 °C
Cabine de segurança biológica
Agitador de banho seco com bloco de aquecimento para tubos de 1,5 mL, regulado para 37 °C, 300 rpm