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1. Medição de IFN bioativo tipo I usando células repórter HEK-Blue IFN-α/β.
Nota: Essas células foram geradas por transfecção estável de células HEK293 com os genes STAT2 e IRF9 humanos para obter uma via de sinalização IFN tipo I totalmente ativa. Eles também contêm o gene repórter da fosfatase alcalina secretada (SEAP) sob o controle do promotor ISG54 induzível por IFN-α/β. A estimulação dessas células com IFN tipo I ativa a via JAK / STAT / ISGF3 e induz a produção de SEAP.
- Mantenha as células HEK-Blue IFN-α/β em DMEM suplementado com 10% de FBS. Coloque-os em placas a uma densidade de 50.000 células por poço em uma placa de fundo plano de 96 poços, com um volume final de 180 μl.
- Misture 220 μl de PBMCs (diluídas a 850.000 células/ml) ou 220 μl de células dendríticas plasmocitoides (pDCs) (em uma concentração variando de 100.000 a 500.000 células/ml) com 30 μl de células T infectadas (diluídas a 106 células/ml) por poço em uma placa de 96 poços com fundo em U.
- Incube coculturas a 37 ° C e 5% de CO2 por 18-22 horas e, em seguida, transfira-as para uma placa de 96 poços de fundo em V. Centrifugue por 5 min a 400 x g.
- Adicionar 20 μl de sobrenadante de cocultura a cada alvéolo em duplicado. Cada placa também requer um conjunto de controles de padrão interno (IFNα humano, concentração final de 100 U/ml a 2.500 U/ml). Incubar as placas a 37 °C e 5% de CO2 durante 18-22 horas.
- Determine os níveis de atividade da fosfatase alcalina usando a solução QUANTI-Blue, que muda de rosa para roxo / azul na presença da enzima. Prepare o QUANTI-Blue seguindo as recomendações do fabricante. Adicionar 180 μl desta solução a cada alvéolo de uma placa de fundo plano de 96 poços. Para cada poço também adicione 20 μl dos sobrenadantes de células HEK-Blue IFN-α/β induzidas e incube a placa em uma incubadora a 37 ° C até que a cor se desenvolva nos poços de controle padrão de IFN.
- Avaliar os níveis de PAEA utilizando um espectrofotómetro a 620-655 nm e determinar a concentração de IFN tipo I por extrapolação a partir da parte linear da curva padrão de IFN.