Uma técnica para a geração de partículas semelhantes ao vírus da gripe por meio de um sistema de mamíferos

Resumo

Fonte: Arevalo, M. T., et al.Expressão e Purificação de Partículas Semelhantes a Vírus para Vacinação. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra a geração de partículas semelhantes ao vírus da gripe (VLPs) em um sistema de mamíferos. Ao expressar três vetores de expressão eucariótica - codificando diferentes proteínas estruturais virais - em células hospedeiras de mamíferos adequadas, as proteínas virais expressas se auto-montam em VLPs na membrana plasmática do hospedeiro e são liberadas por brotamento da superfície celular.

Protocolo

1. Sistema de Expressão de Mamíferos para Geração de Influenza H3N2 VLP

1. Subclone as glicoproteínas estruturais virais hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA) e vírus da imunodeficiência humana (HIV) Gag (antígeno específico do grupo) p55 em vetores de expressão eucariótica, como o pTR600 descrito anteriormente.
2. Amplificar o DNA em Escherichia coli quimicamente competente (por exemplo, DH5α) e isolar o plasmídeo de grau de transfecção usando um kit de purificação de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade de DNA depende do rendimento e das necessidades do usuário.
3. Manter a linhagem celular de mamíferos, 293T, em meio de crescimento contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 °C com 5% de CO₂ em uma incubadora umidificada.
4. Cultive células de modo que um frasco de cultura de tecidos T-150 contenha 45-75 x 10⁶ células por frasco, de modo que o frasco obtenha aderência celular completa e 85-95% de confluência celular no dia seguinte. Inspecione as células ao microscópio para a confluência desejada.
   nota: A alta densidade celular é normalmente recomendada para produzir a expressão ideal de proteínas com citotoxicidade mínima ao usar reagentes de transfecção comerciais, no entanto, a confluência excessiva pode resultar no acúmulo de subprodutos de resíduos celulares e reduzir a viabilidade celular.
5. No dia da transfecção, preparar a mistura de lipossomas e ADN de acordo com as recomendações do fabricante e transfectar células de ADN com uma composição de ADN de 1:1:2 de HA:NA:Gag com uma quantidade total de ADN de 40 μg por balão T-150. Diluir as soluções de ADN e lipossomas em meios de transfecção isentos de soro, sem antibióticos, de modo a que cada balão contenha um volume total de 20-30 ml.
   nota: A proporção de construções genéticas pode exigir otimização do usuário. Embora não demonstrado aqui, um procedimento de transfecção semelhante foi realizado com o vírus sincicial respiratório (VSR) F e HIV Gag na proporção de 1:1. Para plasmídeos de expressão única DENV e CHIKV, um total de 20 μg de DNA por frasco T-150 é usado para expressão ideal. As proporções de reagentes de DNA:transfecção são otimizadas pelo usuário. Use o meio de transfecção recomendado com base no método de transfecção, ou seja, as transfecções lipídicas policatiônicas recomendam a redução ou ausência de soro fetal bovino, portanto, o meio pode ser suplementado com hormônios de crescimento e oligoelementos para apoiar o crescimento na ausência de soro.
6. Retorne os frascos a 37 °C com incubadora de CO₂ a 5%. Para um volume de 200 ml, utilizar 9 balões T-150. As células são mantidas em meio de cultura de transfecção até o dia da colheita da VLP.
7. Colete o sobrenadante da cultura das células após 72-96 horas após a transfecção, dependendo do antígeno, ou quando a viabilidade celular diminuir para 70-80%, conforme estimado por inspeção microscópica. Transferir o sobrenadante para tubos cónicos de 50 ml e centrifugar as células a 500 × g durante 5 min a 4 °C para sedimentar os restos celulares.
   Nota: A substituição do sobrenadante de 3 dias por meios de transfecção frescos, pré-aquecidos e sem soro para células aderentes produzirá um segundo lote de VLPs com rendimento semelhante ou ligeiramente reduzido e deve ser otimizado pelo usuário.
8. Sobrenadante de piscina e filtrar através de uma membrana de poros de 0,22 μm antes da sedimentação por ultracentrifugação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit Maxi de Plasmídeo	Qiagen	Rolamento 12163
DMEM	Cellgro	Telefone: 10-013
Lipofectamina	Tecnologias da Vida	L3000075	Lipofectamina 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Tecnologias da Vida	31985062
Placa misturadora multiponto Cimarec I 6	ThermoFisher Scientific	50094596
Tubos de ultracentrífuga Polyclear	Seton	Nº 7025
Parte superior do filtro de vácuo de 0,22 μm (500 mL)	Nalgene	Rolamento 569-0020
Glicerol	sigma	G5516