Geração de partículas semelhantes ao vírus Chikungunya usando o sistema de expressão de baculovírus em células de insetos

Resumo

Fonte: Arevalo, M. T. et al., Expressão e Purificação de Partículas Semelhantes a Vírus para Vacinação.J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo mostra como partículas semelhantes a vírus, VLPs são geradas infectando células de insetos com um baculovírus recombinante carregando o do gene do vírus chikungunya. O vírus recombinante infecta as células, levando à formação, montagem e liberação de VLP no meio de cultura para uso potencial na produção de vacinas.

Protocolo

1. Expressão de partículas semelhantes ao vírus Chikungunya (VLP) usando o sistema de células de baculovírus/insetos

1. Gerar baculovírus recombinante expressando proteínas de capsídeo e envelope do vírus chikungunya (C-E3-E2-6K-E1) da cepa S-27 usando um sistema comercial de expressão de baculovírus.
2. Cultivar células Sf9 de Spodoptera frugiperda em meio de crescimento Sf9 isento de soro com penicilina 100 U/ml e estreptomicina 100 μg/ml a 28 °C. Utilizar 3-5 x 10,5^c/ml para iniciar culturas de frascos giratórios para o crescimento de células em suspensão. Passagem rotineiramente quando atingem densidades celulares de 2-4 x 10⁶ c/ml (a cada 3-4 dias).
3. Cultura de células Sf9 em suspensão em balões giratórios com agitação a 130 rpm em sistema de placa agitadora multiponto. Para uma aeração adequada, manter os volumes de cultura em não mais de metade do volume do balão giratório.
4. Para a expressão de Chikungunya ou CHIK VLPs, infectar células Sf9 a uma densidade de 2 x 10⁶ células/ml com baculovírus recombinante a uma multiplicidade de infecção de 1 e retornar à incubadora de 28 °C. Normalmente, infecte um ou dois frascos giratórios, contendo 250 ml de células Sf9.
   nota: Embora não usemos esse método, as células Sf9 podem ser cultivadas em frascos agitadores a 28 ° C usando uma plataforma agitadora.
5. Colheita de culturas após 72-96 horas pós-infecção, ou quando a viabilidade celular tiver diminuído para 70-80% conforme determinado pela Exclusão do Azul de Tripano de acordo com o protocolo do fabricante.
   nota: As células continuam a proliferar enquanto infectadas e há uma viabilidade de ~ 80% em culturas Sf9 infectadas com baculovírus CHIK VLP recombinante 3 dias após a infecção (dpi). As células infectadas por baculovírus têm aparência maior. A morfologia também pode mudar de redonda para oblonga. Nos estágios finais das infecções por baculovírus, as células começaram a lisar.
6. Transferir as culturas directamente da cultura em suspensão para tubos cónicos de 50 ml e centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
7. Colete sobrenadantes e filtre através de uma membrana de poros de 0,22 μm antes da sedimentação por ultracentrifugação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Opti-MEM I	Tecnologias da Vida	31985062
Sistema de expressão de baculovírus Bac-to-Bac	Tecnologias da Vida	Rolamento 10359-016
Parte superior do filtro de vácuo de 0,22 μm (500 mL)	Nalgene	Rolamento 569-0020
SFM-900 II	ThermoFisher Scientific	Rolamento 10902-096
Placa misturadora multiponto Cimarec I 6	ThermoFisher Scientific	50094596