Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Manuseio, preparação e indução de inflamação em animais
- Use camundongos machos de 4 a 6 semanas com uma faixa de peso de 16 a 20 g. Nota: Se os camundongos forem mais velhos ou mais pesados, eles apresentam excesso de gordura ao redor do vaso, limitando a observação microscópica.
- Esterilize todas as ferramentas e mesa do microscópio antes da cirurgia.
- Injete 20 mg / kg de LPS (lipopolissacarídeo) por via intraperitoneal 4 horas antes da microscopia no camundongo vivo para induzir uma inflamação bacteriana.
- Pré-aqueça uma solução salina a 0,9% em banho-maria a 37 °C para umidificar a câmara plástica e o tecido do mesentério.
- Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg) logo antes do procedimento de microscopia. Anestesia alternativa pode ser usada, por exemplo, inalação de isoflurano a 2%. Confirme a anestesia adequada pela perda de resposta à estimulação reflexa (pinça do dedo do pé ou da cauda com pressão firme).
- Depile o abdômen usando um barbeador e remova os pelos soltos com gaze saturada com etanol 70%.
- Aplique pomada veterinária nos olhos do camundongo para evitar o ressecamento, enquanto estiver sob anestesia.
2. Cirurgia
- Esterilize o abdômen usando etanol 70%. Este método não é um método estéril e pode ser letal no final do experimento.
- Realize uma laparotomia mediana: Abra a pele abdominal usando uma pinça pequena e curva e uma tesoura pequena. Identifique os vasos epigástricos e abra o peritônio na região da linha alba, para proteger os vasos.
- Aplique algumas gotas de solução salina pré-aquecida na cavidade abdominal para manter o tecido úmido.
- Marcar leucócitos e plaquetas fluorescentemente injetando 50 μl de rodamina 6G (1 mg/ml) retroorbitalmente.
- Exteriorizar uma alça de íleo e colocá-la numa placa de Petri com um diâmetro de 10 cm; manter o tecido húmido aplicando a solução salina pré-aquecida a 37 °C (0,9%) de dois em dois minutos.
3. Microscopia Intravital
- Coloque o mouse embaixo do microscópio e coloque a veia do mesentério com um diâmetro de 200 a 300 μm no centro da visão. Escolha um recipiente sem gordura visível.
- Não toque nos vasos do mesentério, evitando assim a estimulação do endotélio. Manuseie a alça do íleo com cuidado.
- Visualize as interações entre células sanguíneas e endoteliais com um microscópio invertido ou vertical e uma câmera usando o software do microscópio. Registre as interações entre células sanguíneas e endotélio por 1 minuto em 4 veias diferentes por camundongo.
- Eutanasiar o camundongo por luxação cervical após a conclusão dos experimentos de imagem.
4. Análise
- Realize a análise offline e cega para todos os parâmetros. Realize a análise usando qualquer programa de software adequado.
- Confirme condições de fluxo sanguíneo comparáveis estáveis e interindividuais em cineclipes de alta resolução de tempo (taxa máxima de quadros) focados no fluxo intraluminal de células sanguíneas.
- Quantifique o número de leucócitos rolantes. Portanto, desenhe uma linha vertical através da veia e conte todos os leucócitos que cruzam essa linha em 1 min.
- Determine a velocidade de rolamento medindo o tempo que um único leucócito precisa para passar uma distância de 50 μm enquanto rola de forma estável no endotélio. Para fazer isso, desenhe duas linhas verticais a uma distância de 50 μm através da veia.
- Meça o tempo que um leucócito representativo precisa para ir de uma linha à outra. Calcule a velocidade dos leucócitos dividindo 50 μm pelo tempo necessário (μm/s).
- Meça a adesão leucocitária em um campo de 0,04 mm2. Para fazer isso, desenhe um quadrado com um comprimento lateral de 200 μm na veia.
- Conte os leucócitos aderentes firmes, definidos como nenhum movimento visível por 30 segundos, dentro deste quadrado.
- Conte o número de plaquetas ligadas a um leucócito para quantificar as interações plaqueta-leucócitos.
