Injeção subcutânea de antígeno bacteriano para induzir inflamação sistêmica em modelo murino

Resumo

Fonte: John, S. et al., Uveíte micobacteriana primed (PMU) como modelo para uveíte pós-infecciosa.J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a indução de inflamação sistêmica em um camundongo anestesiado. A injeção de depósitos adjuvantes de antígenos micobacterianos desencadeia a liberação de citocinas e inflamação localizada. Os vasos linfáticos se abrem, permitindo a entrada de células imunes nos gânglios linfáticos e a ativação das células T, que liberam citocinas pró-inflamatórias, levando à inflamação generalizada.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação do antigénio para injecção subcutânea

1. Execute todos os procedimentos nesta seção dentro de uma capela de exaustão química para evitar a inalação ou contato da pele com o pó de Mycobacterium tuberculosis, Mtb H37Ra. Manuseie de acordo com suas políticas institucionais para o Adjuvante de Freund Completo (normalmente BSL-1). Isso inclui o uso de luvas resistentes a produtos químicos, óculos de segurança e roupas de trabalho de proteção (jaleco).
2. Use uma boa técnica estéril para evitar a contaminação de reagentes que serão introduzidos em animais experimentais.
3. Faça a suspensão de Mtb em solução salina tamponada com fosfato (PBS) misturando 5 mg de pó liofilizado e morto pelo calor de Mycobacterium tuberculosis H37Ra com 2,5 mL de PBS frio em um tubo de microcentrífuga de 5 mL. Vortex uma vez por 30 segundos e depois coloque no gelo.
4. Para gerar uma suspensão fina do H37Ra em PBS, sonicar a suspensão no gelo por 5 min.
   1. Solte o corpo da unidade conversora e limpe a sonda com um cotonete embebido em álcool 70% (v/v).
   2. Ligue o sonicador, ajuste a configuração de potência para 4 girando o botão de controle de energia e mergulhe a ponta da sonda no pó micobacteriano contendo PBS. Certifique-se de que a ponta da sonda esteja imersa em pelo menos metade da profundidade da amostra e que a ponta da sonda não esteja tocando a parede do tubo da microcentrífuga.
5. Sonicar a mistura no gelo por 30 segundos, fazer uma pausa de 30 segundos e repetir por um total de 5 minutos para dispersar totalmente o pó em uma suspensão uniforme sem aquecer o líquido.
6. Adicione 2,5 mL de adjuvante incompleto de Freund à mistura e repita o processo de sonicação no gelo até que a emulsão forme uma consistência semelhante a pasta de dente.
7. Defina a potência para 0 usando o botão de controle e desligue a unidade para encerrar a sonicação. Remova a ponta da suspensão e limpe a sonda com um cotonete embebido em álcool.
8. Armazenar a emulsão de antigénio a 4 °C. A produção de lotes da emulsão ajudará a garantir a consistência entre as experiências. A emulsão pode ser armazenada a 4 °C por até 3 meses.

2. Injeção subcutânea

1. Realize a injeção subcutânea uma semana antes da injeção intravítrea (designada como dia -7).
2. Carregue uma seringa de 1 ml (sem agulha) com a emulsão micobacteriana. Devido à viscosidade e opacidade da emulsão, bolhas de ar difíceis de ver podem encher a seringa.
   1. Para evitar bolhas de ar na seringa, depois de carregar 0,2-0,3 mL de emulsão, inverta a seringa (ponta voltada para cima) e bata suavemente com a seringa repetidamente na borda de um balcão para trazer as bolhas à superfície.
3. Expulse o ar da seringa e continue a encher a seringa. Inverta e bata intermitentemente até encher.
4. Coloque uma agulha de 25 G na seringa e avance a emulsão para encher a agulha. Guarde a seringa no gelo até ser usada.
5. Para realizar a injeção subcutânea com segurança, anestesie o camundongo ou utilize métodos de contenção humanos que permitam fácil acesso aos quartos traseiros do animal.
6. Para anestesiar para injeção subcutânea, coloque o animal em uma câmara de indução de isoflurano (3%-4% para indução e 1%-3% para manutenção). Uma vez anestesiado, certifique-se de que o camundongo tenha uma frequência respiratória lenta e não apresente sinais de desconforto respiratório.
7. Coloque as injeções subcutâneas na superfície dorsal dos quadris ou na superfície ventral das pernas proximal à região dos gânglios linfáticos inguinais.
   1. Insira cuidadosamente a agulha para evitar a injeção no músculo. Injete 0,05 mL da emulsão Mtb no espaço subcutâneo. Não remova a agulha imediatamente para permitir que a emulsão espessa seja totalmente injetada.
   2. Repita a injeção nos lados esquerdo e direito para um total de 0,1 mL por animal.
8. Se anestesiado, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento quente até a recuperação completa. Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
9. Retorne o mouse à gaiola após a recuperação completa e rotule o cartão da gaiola com a data da injeção subcutânea.
10. Forneça analgesia com paracetamol oral (200 mg/kg/dia), mas não anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), pois os agentes anti-inflamatórios podem afetar a indução de uveíte.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Adjuvante incompleto de Freund	BD Difco, Nova Jérsia, EUA	Rolamento 263910
Extrato de micobactérias liofilizado H37Ra	BD Difco, Nova Jérsia, EUA	231141
Agulha de insulina	Exel International, EUA	Rolamento 26029	1 mL
Isoflurano
Pbs	Gibco	14190
RM2255	Leica Biosystems, IL, EUA		Seccionamento de Tecidos
Seringa para TB	Becton, Dickinson and Company, NJ, EUA	309602	1 mL
Tylenol	Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, EUA	NDC 50580-614-01	paracetamol