Um modelo murino de uveíte micobacteriana preparada para estudar uveíte pós-infecciosa

Resumo

Fonte: John, S., et al. Uveíte micobacteriana (UGP) como modelo para uveíte pós-infecciosa. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra um método para gerar um modelo de camundongo de uveíte micobacteriana (PMU) para estudar uveíte pós-infecciosa. Após a indução de PMU por injeção intravítrea de Mycobacterium tuberculosis morto pelo calor em um camundongo previamente imunizado com o mesmo imunógeno, a progressão da inflamação crônica no olho é analisada por meio de exames de imagem e histopatológicos

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação do antigénio para injecção subcutânea

1. Realize todos os procedimentos nesta seção dentro de uma capela de exaustão química para evitar a inalação ou contato da pele com o pó de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) H37Ra. Manuseie de acordo com suas políticas institucionais para o Adjuvante de Freund Completo (normalmente BSL-1). Isso inclui o uso de luvas resistentes a produtos químicos, óculos de segurança e roupas de trabalho de proteção (jaleco).
2. Use uma boa técnica estéril para evitar a contaminação de reagentes que serão introduzidos em animais experimentais.
3. Faça a suspensão de Mtb em solução salina tamponada com fosfato (PBS) misturando 5 mg de pó de Mtb H37Ra liofilizado e morto pelo calor com 2,5 mL de PBS frio em um tubo de microcentrífuga de 5 mL. Vortex uma vez por 30 segundos e depois coloque no gelo.
4. Para gerar uma suspensão fina do H37Ra em PBS, sonicar a suspensão no gelo por 5 min.
   1. Solte o corpo da unidade conversora e limpe a sonda com um cotonete embebido em álcool 70% (v/v).
   2. Ligue o sonicador, ajuste a configuração de potência para 4 girando o botão de controle de energia e mergulhe a ponta da sonda no pó micobacteriano contendo PBS. Certifique-se de que a ponta da sonda esteja imersa em pelo menos metade da profundidade da amostra e que a ponta da sonda não esteja tocando a parede do tubo da microcentrífuga.
5. Sonicar a mistura no gelo por 30 segundos, fazer uma pausa de 30 segundos e repetir por um total de 5 minutos para dispersar totalmente o pó em uma suspensão uniforme sem aquecer o líquido.
6. Adicione 2,5 mL de adjuvante incompleto de Freund à mistura e repita o processo de sonicação no gelo até que a emulsão forme uma consistência semelhante a pasta de dente.
7. Defina a potência para 0 usando o botão de controle e desligue a unidade para encerrar a sonicação. Remova a ponta da suspensão e limpe a sonda com um cotonete embebido em álcool.
8. Armazenar a emulsão de antigénio a 4 °C. A produção de lotes da emulsão ajudará a garantir a consistência entre as experiências. A emulsão pode ser armazenada a 4 °C por até 3 meses.

2. Injeção subcutânea

1. Realize a injeção subcutânea uma semana antes da injeção intravítrea (IVT) (designada como dia -7).
2. Carregue uma seringa de 1 ml (sem agulha) com a emulsão micobacteriana. Devido à viscosidade e opacidade da emulsão, bolhas de ar difíceis de ver podem encher a seringa.
   1. Para evitar bolhas de ar na seringa, depois de carregar 0,2-0,3 mL de emulsão, inverta a seringa (ponta voltada para cima) e bata suavemente com a seringa repetidamente na borda de um balcão para trazer as bolhas à superfície.
3. Expulse o ar da seringa e continue a encher a seringa. Inverta e bata intermitentemente até encher.
4. Coloque uma agulha de 25 G na seringa e avance a emulsão para encher a agulha. Guarde a seringa no gelo até ser usada.
5. Para realizar a injeção subcutânea com segurança, anestesie o camundongo ou utilize métodos de contenção humanos que permitam fácil acesso aos quartos traseiros do animal.
6. Para anestesiar para injeção subcutânea, coloque o animal em uma câmara de indução de isoflurano (3%-4% para indução e 1%-3% para manutenção). Uma vez anestesiado, certifique-se de que o camundongo tenha uma frequência respiratória lenta e não apresente sinais de desconforto respiratório.
7. Coloque as injeções subcutâneas na superfície dorsal dos quadris ou na superfície ventral das pernas proximal à região dos gânglios linfáticos inguinais.
   1. Insira cuidadosamente a agulha para evitar a injeção no músculo. Injete 0,05 mL da emulsão Mtb no espaço subcutâneo. Não remova a agulha imediatamente para permitir que a emulsão espessa seja totalmente injetada.
   2. Repita a injeção nos lados esquerdo e direito para um total de 0,1 mL por animal.
8. Se anestesiado, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento quente até a recuperação completa. Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
9. Retorne o mouse à gaiola após a recuperação completa e rotule o cartão da gaiola com a data da injeção subcutânea.
10. Forneça analgesia com paracetamol oral (200 mg/kg/dia), mas não anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), pois os agentes anti-inflamatórios podem afetar a indução da uveíte.

3. Preparação da reserva de antigénios para injecção intravítrea

1. Execute todos os procedimentos nesta seção em condições estéreis apropriadas para evitar a contaminação da suspensão intravítrea de Mtb.
2. Faça as suspensões intravítreas.
   1. Para indução de panuveíte leve a moderada, faça a suspensão intravítrea na concentração de 5 mg / mL adicionando 5 mg do extrato de micobactéria a 1 mL de 1x PBS.
   2. Para indução de panuveíte moderada a grave, faça a suspensão intravítrea na concentração de 10 mg/mL adicionando 10 mg do extrato de micobactérias a 1 mL de 1x PBS.
3. Vortex uma vez por 30 segundos e depois coloque no gelo.
4. Para gerar uma suspensão fina do H37Ra em PBS, sonicar a suspensão no gelo por 10 minutos, conforme descrito na etapa 1.4. Aliquotar esta solução de reserva em volumes de 100 μL e conservá-la a -20 °C.
5. Antes de usar, descongele em temperatura ambiente e vórtice em alta por 1 min. Mantenha as alíquotas no gelo enquanto as transporta para o biotério.

4. Procedimento de injeção intravítrea no dia 0

1. Preparação animal
   1. Use luvas de exame ajustadas e coloque o mouse em uma balança para obter seu peso em gramas.
   2. Administre uma injeção intraperitoneal de 0,02 mL / g de peso corporal de uma solução contendo 100 mg / mL de cetamina e 20 mg / mL de xilazina misturada com água estéril para anestesiar o animal. Uma abordagem alternativa inclui indução usando ~ 1.5% de isoflurano (inalado).
   3. Aguarde aproximadamente 2 minutos para que o mouse adormeça e, em seguida, coloque-o em uma caixa de aquecimento e cubra a tampa. Realize testes de reflexo da dor, como pinça de orelha, dedo do pé e cauda, para avaliar a profundidade da anestesia para o procedimento.
   4. Uma vez adormecido, anestesiar a córnea com 1 gota de tetracaína a 0,5% (v/v). Evite colocar tetracaína perto do nariz ou da boca do camundongo. Após 10 s, enxugue o excesso de líquido.
      nota: Observou-se que a dilatação da íris e a visualização da câmara anterior (CA) melhoram quando a anestesia tópica é administrada, possivelmente devido à melhora da supressão do reflexo corneano com a anestesia sistêmica e tópica combinada. No entanto, esta etapa pode ser omitida, se desejado.
   5. Dilate a pupila com 1 gota de fenilefrina a 2,5% (v/v). Tenha cuidado para evitar gotículas em excesso que possam entrar no nariz ou na boca. Após 2-3 min, retire o excesso de líquido.
   6. Para diminuir o risco de endoftalmite, adicione 1 gota de betadina a 5% na superfície dos olhos e nos cabelos ao redor. Deixe no olho por 2-3 min.
      nota: Execute todos os procedimentos desta seção sob condições estéreis apropriadas para evitar endoftalmite.
   7. Remova a betadina e cubra o olho com hipromelose (0,3%) ou gel ocular carbômero 0,2% p / p) para evitar o ressecamento sob anestesia. Isso também ajudará a prevenir a formação de catarata.
2. Configurando o sistema de microinjeção
   1. Realize a injeção intravítrea usando uma microbomba conectada a um controlador de bomba de microsseringa e uma seringa de injeção (Figura 1A-C). Em alternativa, injetar com uma agulha de 33 G acoplada a uma seringa de Hamilton, conforme descrito na subsecção 4.4.
   2. Conecte uma agulha de 34 G ao suporte da injeção para montar o injetor. Afrouxe a tampa de rosca prateada na extremidade frontal do suporte de injeção e deslize a agulha para dentro do corpo do suporte até a metade. Aperte bem a tampa de rosca prateada com os dedos.
   3. Conecte a tubulação ao suporte de injeção conforme mencionado nas etapas 4.2.4-4.2.5.
   4. Para inserir a tubulação no suporte de injeção, solte o parafuso de plástico na extremidade traseira do suporte, deslize a tubulação pela junta interna e aperte o parafuso.
   5. Mantenha um pequeno espaço com a extremidade da tubulação para evitar danos à tubulação durante a injeção. Consulte a Figura 1C.
   6. Descongelar uma alíquota de 100 μL da suspensão de estoque de micobactérias.
   7. Adicione 3 μL de uma solução de fluoresceína sódica a 1% (AK-Fluor) e vortex bem.
   8. Carregue uma seringa de 10 μL com a mistura de antígeno e fluoresceína sem incluir bolhas de ar.
   9. Remova a agulha de carregamento da seringa e deslize o tubo através da junta da tampa de rosca prateada até que a ponta atinja a marca zero no corpo da seringa.
   10. Assim que a ponta do tubo estiver alinhada corretamente na posição desejada, aperte bem a tampa de rosca.
   11. Lave a solução na seringa através do tubo de injeção para carregar totalmente o sistema. Em seguida, repita os passos 4.2.8-4.2.11 para recarregar a seringa para injeção.
   12. Para instalar a seringa carregada na microbomba, pressione o clampbotão de liberação na extremidade da microbomba para abrir a seringa clamps.
   13. Posicione a tampa do êmbolo no suporte da tampa do êmbolo na extremidade traseira da microbomba.
   14. Em seguida, deslize o colar da seringa no batente do colar e o corpo da seringa no grampo da seringa.
   15. Solte o clamp botão e aperte o parafuso de retenção do êmbolo. Consulte a Figura 1D.
   16. Deslize o suporte de injeção e a agulha através do o-clamp no aparelho de injeção estereotáxica. Esta é uma plataforma personalizada; Alternativamente, a seringa pode ser segurada e posicionada manualmente.
   17. Defina o volume de infusão e a taxa de volume de infusão no controlador da bomba de microseringa para injetar 500 nL por ciclo a uma taxa de 40 nL/s, respectivamente.
       nota: Taxas de injeção mais rápidas podem ser usadas, no entanto, mais refluxo pode ser experimentado antes que o reposicionamento da agulha possa ser alcançado.
   18. Teste o sistema para garantir o funcionamento correto antes de realizar uma injeção intravítrea.
       nota: Quando o sistema de injeção estiver funcionando corretamente, a ativação de um ciclo de injeção usando o pedal ou a almofada de controle produzirá um movimento visível do suporte da tampa do êmbolo e uma pequena gota de líquido esverdeado será vista na ponta da agulha. No caso de nenhum líquido ser produzido, ative ciclos adicionais ou lave e recarregue a seringa.
   19. Antes de injetar o olho, limpe suavemente a agulha com uma almofada de etanol a 95%.
3. Procedimento de injeção intravítrea
   1. O mouse é colocado em um aparelho estereotáxico para realizar o procedimento de injeção.
   2. Mantenha o palco/plataforma em que o mouse repousa aquecido prendendo 2-3 toalhas de papel em sua superfície.
   3. Coloque o mouse em uma posição de bruços na plataforma. Use as barras auriculares direita e esquerda para fixar suavemente a cabeça do animal. Consulte a Figura 1E.
   4. Posicione o mouse e oriente-o sob o escopo de forma que o aspecto nasal superior do olho direito fique visível.
   5. Use uma agulha de 30 G para deslocar os cílios e expor a esclera. Visualize o limbo e o vaso sanguíneo radial.
   6. Use uma agulha estéril de 30 G para fazer um orifício guia na esclera 1-2 mm posterior ao limbo.
   7. Insira a agulha de 34 G presa ao suporte de injeção no olho através do orifício guia em um ângulo que evite a lente, mas coloque a ponta da agulha na cavidade vítrea.
   8. Usando o controlador da bomba de microseringa, injete cuidadosamente 1 μL do extrato de Mtb na cavidade vítrea. Em caso de refluxo consistente, aumente o volume de injeção para 1,5 μL para garantir a administração adequada da dose.
      nota: Para controles simulados, injete 1 μL de PBS no olho do animal.
   9. Verifique a colocação intravítrea pela visualização de um reflexo esverdeado no olho. Consulte a Figura 1F.
   10. Após 10 s, retire a agulha do olho. Observe qualquer refluxo.
   11. Remova o mouse da plataforma, coloque 0,3% de hipromelose ou 0,2% p / p de pomada ocular de carbômero em ambos os olhos para proteção da córnea e vá para a caixa de aquecimento de recuperação.
   12. Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Não retorne à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
   13. Quando o camundongo estiver totalmente acordado, volte para a gaiola e adicione uma garrafa de água medicamentosa com paracetamol (200-300 mg / kg / dia). Rotule o cartão de gaiola com a data da injeção de IVT.
   14. As injeções intravítreas são geralmente bem toleradas. Os sinais clínicos que podem indicar dor e a necessidade de remoção do estudo incluem alopecia periocular (indicativa de autotrauma), ulceração da córnea, perda de peso e postura curvada.

Resultados

Figura 1: Configuração da injeção intravítrea em camundongos. A injeção intravítrea é realizada no olho do rato utilizando (A) um controlador de bomba de microseringa ligado à (B) Microbomba e (C) uma seringa de injeção. A seringa é carregada e montada na microbomba (D). A cabeça do mouse é posicionada usando barras auriculares (

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AK-FLUOR	Akorn Pharmaceuticals, IL, EUA		10% de fluoresceína sódica 100 mg / mL em frasco para injetáveis de 5 mL
Analisado	Akorn Saúde Animal, IL, EUA	NDC 59399-110-20	Xilazina 20 mg/mL
Solução de preparação oftálmica estéril Betadine 5%	Alcon, TX, EUA	8007-1
Agulhas de Deslizamento de Precisão B-D -25 G	Becton, Dickinson and Company, NJ, EUA	305122
Agulha B-D Precision Glide -30-G	Becton, Dickinson and Company, NJ, EUA	305106
Bond MAX, Bond Rx	Leica Biosystems, IL, EUA		Sistema automatizado de coloração IHC
Pomada de cloranfenicol	Martindale Pharma, Romford, Reino Unido		1% p/p Cloranfenicol
EG1150H	Leica Biosystems, IL, EUA		Incorporação de tecidos
Envisu R2300	Bioptigen/Leica		Máquina de OCT
Adjuvante incompleto de Freund	BD Difco, Nova Jérsia, EUA	Rolamento 263910
Pomada lubrificante para os olhos GenTeal	Alcon, TX, EUA	---
GenTeal gel lubrificante para os olhos	Alcon, TX, EUA	---
Extrato de micobactérias liofilizado H37Ra	BD Difco, Nova Jérsia, EUA	231141
Agulha Hamilton RN (33/12/2)S	Hamilton, Reno, NV	7803-05 (33/12/2)	33 gramas
Seringa Hamilton	Hamilton, Reno, NV	CAL7633-01	5 μL
Agulha de insulina	Exel International, EUA	Rolamento 26029	1 mL
Isoflurano
Ketaset	Zoetis, EUA	377341	Cetamina HCL 100 mg/mL
Bomba de seringa de microinjeção e Micro4Controller	Instrumentos de Precisão Mundial, FL, EUA	UMP3
Mícron IV	Laboratórios de Pesquisa Phoenix, Pleasanton, CA		Máquina de imagem alternativa/OCT
Seringa Nanofil 10 μL	Instrumentos de Precisão Mundial, FL, EUA	NANOFIL
Kit de Injeção Intraocular Nanofil	Instrumentos de Precisão Mundial, FL, EUA	Kit de E/S
Olympus SZX10	Olimpo		Escopo de dissecção
Pbs	Gibco	14190
Solução oftálmica de cloridrato de fenilefrina USP 2,5% estéril 15 mL	Akorn Pharmaceuticals, IL, EUA	17478020115
RM2255	Leica Biosystems, IL, EUA		Seccionamento de Tecidos
Seringa para TB	Becton, Dickinson and Company, NJ, EUA	309602	1 mL
Tetracaína 0,5%	Alcon, TX, EUA	1041544
Série Tissue Tek VIP	Sakura Finetek EUA, Inc., CA.		Histologia Processamento de Tecidos
Tropicamida 1%	Chauvin Pharmaceuticals, Romford, Reino Unido		Mínimos
Tylenol	Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, EUA	NDC 50580-614-01	paracetamol
Viscotears	Novartis Pharmaceuticals, Camberley, Reino Unido		Gel para os olhos carbômero 0,2% p/p