Preparação e quantificação do inóculo de Mycobacterium bovis BCG lux para infecção

Resumo

Fonte: Asai, M. et al., Uso do invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecção para estudar o complexo Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a preparação e quantificação do inóculo lux de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin usando ensaio de bioluminescência e a enumeração de unidades formadoras de colônias. O inóculo preparado pode ser usado para estudos de infecção.

Protocolo

NOTA: Todo o trabalho descrito abaixo deve ser realizado em um laboratório CL2 dentro de um gabinete de segurança microbiológica (MSC) classe 2 seguindo as diretrizes locais de saúde e segurança.

1. Preparação de M. bovis BCG lux para infecção

1. Descongele um estoque congelado de 1,2 mL de glicerol (15%) de M. bovis BCG lux, a cepa da vacina Montreal transformada com o plasmídeo pSMT1 carregando os genes luxAB de Vibrio harveyi que codificam a enzima luciferase.
2. Inocular 15 mL de caldo Middlebrook 7H9 contendo 0,2% de glicerol, 10% de albumina, dextrose, enriquecimento de catalase (ADC) e 50 μg/mL de higromicina com uma alíquota descongelada de 1,2 mL de BCG lux, em um balão Erlenmeyer de 250 mL rotulado.
3. Colocar o balão num recipiente selado de biossegurança e incubar a 37 °C numa incubadora agitadora orbital a 220 rpm durante 72 h (ou até a cultura atingir a fase intercalarítmica de crescimento).
4. Verifique o crescimento da cultura de BCG lux preparando diluições 1:10 da cultura em tubos de luminômetro usando solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4, tampão fosfato 0,01 M, cloreto de potássio 0,0027 M e cloreto de sódio 0,137 M) em duplicata. Vortex, e carregue os tubos do luminômetro no luminômetro e meça a bioluminescência (unidade de luz relativa [RLU]/mL) usando n-decil aldeído como substrato (1% v/v em etanol absoluto).
   nota: A proporção de RLU/unidades formadoras de colônias (UFC) foi previamente determinada em 3:1 quando o BCG lux foi cultivado in vitro no caldo Middlebrook 7H9.
5. Centrifugar a cultura a 2.175 x g durante 10 min à temperatura ambiente para peletar as células e descartar o sobrenadante num desinfectante adequado com actividade micobactericida conhecida. Descarte todos os resíduos de cultura com desinfetantes apropriados para micobactérias seguindo as diretrizes locais.
6. Lave o pellet celular duas vezes em PBS contendo 0,05% de polissorbato 80 (PBS-T) para evitar a aglomeração bacteriana.
7. Após a lavagem final, decantar o sobrenadante de resíduos, ressuspender o pellet de células micobacterianas em PBS-T e diluir a suspensão micobacteriana até a densidade celular desejada usando medições de RLU.
8. Preparar diluições seriadas de dez vezes do inóculo em placas de 24 poços utilizando PBS-T. Deposite 10 μL em placas de ágar Middlebrook 7H11 (glicerol a 0,5%, higromicina a 50 μg / mL, ácido oleico a 10%, albumina, dextrose, catalase [OADC]) em duplicata para enumerar as contagens de UFC de inóculo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de reação de 1,5 ml (Eppendorf)	Eppendorf	22431021
Pipeta de 20, 200 e 1000 μl e ponteiras filtradas	Qualquer fornecedor	n/a
Placa de cultura de 24 poços	Greiner	Nº 662160
Pipetas de 25 ml e Pipette Boy	Qualquer fornecedor	n/a
Placa de Petri de 3 compartimentos (94/15mm)	Greiner	637102
centrifuga	Qualquer fornecedor	n/a
Armário de segurança classe II	Qualquer fornecedor	n/a
Etanol (>99,7%)	VWR	Número de telefone: 208221.321
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5150
Higromicina B	Corning	30-240CR
Luminômetro (Autolumat LB 953)	Berthold	Rolamento 34622
Tubos de luminômetro	Corning	352054
Microcentrífuga	Qualquer fornecedor	n/a
Ágar Middlebrook 7H11	BD Biociência	Rolamento 283810
Caldo Middlebrook 7H9	BD Biociência	Rolamento 271310
Enriquecimento do ADC de Middlebrook	BD Biociência	212352
Enriquecimento do OADC de Middlebrook	BD Biociência	Rolamento 212240
Mycobacterium bovis BCG lux	vário	n/a
n-decil aldeído	Sigma-Aldrich	D7384-100G
Incubadora com agitação orbital	Qualquer fornecedor	n/a
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Polissorbato 80 (Tween-80)	Sigma-Aldrich	Pág. 8074-500ml
Balão Erlenmeyer com tampa ventilada (250 ml)	Corning	CLS40183
Winterm (V1.08)	Berthold	n/a	Programa LB953.TTB