NOTA: Todo o trabalho descrito abaixo deve ser realizado em um laboratório CL2 dentro de um gabinete de segurança microbiológica (MSC) classe 2 seguindo as diretrizes locais de saúde e segurança.
1. Preparação de M. bovis BCG lux para infecção
- Descongele um estoque congelado de 1,2 mL de glicerol (15%) de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) lux, a cepa da vacina Montreal transformada com o plasmídeo pSMT1 carregando os genes luxAB de Vibrio harveyi que codificam a enzima luciferase.
- Inocular 15 mL de caldo Middlebrook 7H9 contendo 0,2% de glicerol, 10% de albumina, dextrose, enriquecimento de catalase (ADC) e 50 μg/mL de higromicina com uma alíquota descongelada de 1,2 mL de BCG lux, em um balão Erlenmeyer de 250 mL rotulado.
- Colocar o balão num recipiente selado de biossegurança e incubar a 37 °C numa incubadora agitadora orbital a 220 rpm durante 72 h (ou até a cultura atingir a fase intercalarítmica de crescimento).
- Verifique o crescimento da cultura de BCG lux preparando diluições 1:10 da cultura em tubos de luminômetro usando solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4, tampão fosfato 0,01 M, cloreto de potássio 0,0027 M e cloreto de sódio 0,137 M) em duplicata. Vortex e carregue os tubos do luminômetro no luminômetro e meça a bioluminescência (unidade de luz relativa [RLU]/mL) usando n-decil aldeído como substrato (1% v/v em etanol absoluto).
NOTA: A proporção de RLU/unidades formadoras de colônias (UFC) foi previamente determinada em 3:1 quando BCG lux foi cultivado in vitro em caldo Middlebrook 7H9.
- Centrifugar a cultura a 2.175 x g durante 10 min à temperatura ambiente para peletar as células e descartar o sobrenadante num desinfectante adequado com actividade micobactericida conhecida. Descarte todos os resíduos de cultura com desinfetantes apropriados para micobactérias seguindo as diretrizes locais.
- Lave o pellet celular duas vezes em PBS contendo 0,05% de polissorbato 80 (PBS-T) para evitar a aglomeração bacteriana.
- Após a lavagem final, decantar o sobrenadante de resíduos, ressuspender o pellet de células micobacterianas em PBS-T e diluir a suspensão micobacteriana até a densidade celular desejada usando medições de RLU.
- Preparar diluições seriadas de dez vezes do inóculo em placas de 24 poços utilizando PBS-T. Deposite 10 μL em placas de ágar Middlebrook 7H11 (glicerol a 0,5%, higromicina a 50 μg / mL, ácido oleico a 10%, albumina, dextrose, catalase [OADC]) em duplicata para enumerar as contagens de UFC de inóculo.
2. Preparação de larvas de G. mellonella
- Compre larvas de último ínstar de fontes apropriadas e mantenha as larvas no escuro a 18 ° C na chegada e use dentro de 1 semana após a compra. Alternativamente, as larvas podem ser criadas por conta própria seguindo o protocolo de Jojāo et al. Para larvas compradas, descarte todas as larvas mortas, descoloridas ou pupas antes do armazenamento.
NOTA: As larvas pupantes são morfologicamente distinguíveis das larvas do último ínstar.
- Identifique e selecione larvas saudáveis para experimentação, com base na cor creme uniforme com pouca ou nenhuma descoloração (melanização), tamanho (2-3 cm de comprimento), peso (aproximadamente 250 mg), exibindo um alto nível de motilidade e possuindo a capacidade de se endireitar quando virado.
- Conte cuidadosamente as larvas saudáveis (mínimo de 20-30 por grupo) em uma placa de Petri (94/15 mm) forrada com uma camada de papel de filtro (94/15 mm) usando uma pinça de ponta romba para minimizar a contaminação e armazene em temperatura ambiente no escuro até o uso.
3. Infectando G. mellonella com BCG lux
- Minimize a desordem dentro do MSC para reduzir o risco de contaminação e ferimentos por picada de agulha.
- Preparar a plataforma de injecção com fita adesiva de papel de filtro circular (94 mm) numa superfície plana elevada. Superfícies macias ou duras podem ser usadas e dependem inteiramente da preferência do usuário, por exemplo, tampas de pipetas ou uma esponja de limpeza de nylon.
- Esterilize uma microsseringa de 25 μL (25 G) aspirando 3 volumes de etanol a 70% e enxágue novamente com 3 volumes de PBS-T estéril.
- Aspirar 10 μL de inóculo BCG lux (preparado na secção 1) ou PBS-T para a microsseringa esterilizada de 25 μL. Use uma seringa separada para controle negativo PBS-T.
NOTA: Ressuspenda o inóculo BCG lux após 10 injeções para garantir uma suspensão celular uniforme.
- Use uma pinça para pegar uma larva e colocá-la na plataforma de injeção.
- Na plataforma, vire a larva de costas e imobilize-a prendendo a cabeça e a cauda com uma pinça. Localize a última proleg esquerda em contagem regressiva da cabeça da larva e insira cuidadosamente a ponta da agulha (5−6 mm) em um ângulo de 10−20° em relação ao plano horizontal.
nota: Pinças curtas e estreitas permitem fácil imobilização com o mínimo de estresse larval. Preste atenção para não penetrar demais, o que pode perfurar o intestino e causar melanização ou morte não específica do BCG lux.
- Conte as larvas infectadas em uma placa de Petri forrada com uma camada de papel de filtro, uma única placa de Petri de 90 mm pode acomodar até 30 larvas.
- Armazenar a placa de Petri contendo as larvas numa caixa escura ventilada ou não selada dentro de uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
4. Monitorando a sobrevivência de G. mellonella após infecção
- Ao longo do tempo, monitore a sobrevivência das larvas a cada 24 horas. As larvas são consideradas mortas quando não conseguem se mover em resposta ao toque.
5. Medindo a carga in vivo de BCG lux em G. mellonella
- Em cada momento, selecione aleatoriamente cinco larvas infectadas previamente preparadas na seção 3 e esterilize suavemente as superfícies larvais usando cotonetes embebidos em etanol a 70%.
NOTA: Esta etapa é importante ao plaquear o homogeneizado larval para enumeração de UFC micobacteriana, pois as larvas não esterilizadas podem levar à contaminação.
- Coloque as larvas individualmente em 2 mL de tubos de matriz de lise contendo 800 μL de PBS estéril.
- Homogeneizar as larvas usando um homogeneizador por 60 s a 6,0 m/s.
- Centrifugue os tubos de lise a 3.500 x g por 5 s para remover o homogeneizado das tampas e decanta cuidadosamente o homogeneizado em tubos de luminômetro estéreis individualmente.
nota: Para enumeração de UFC (etapa 5.7), certifique-se de reservar 100 μL de homogenato em um tubo de reação estéril de 1,5 mL.
- Recupere qualquer homogenato restante lavando os tubos da matriz de lise com 1 mL de PBS-T e pipeta nos tubos do luminômetro correspondentes.
- Vortex os tubos do luminômetro e meça a bioluminescência dos homogeneizados descritos anteriormente na etapa 1.4.
- Preparar diluições seriadas dez vezes do homogenato em placas de cultura de 24 poços usando PBS-T. Colocar 10 μL da diluição em placas de ágar Middlebrook 7H11 contendo glicerol a 0,5%, higromicina a 50 μg/mL, OADC a 10% e piperacilina 20 μg/mL, para determinar a relação RLU/UFC de BCG lux após infecção in vivo.
NOTA: A piperacilina elimina a microbiota nativa de G. mellonella com inibição mínima do crescimento de BCG lux.
