Um modelo de camundongo com bolsa de ar para coleta de exsudato inflamatório induzido por lipopolissacarídeo

Neste artigo

Resumo

Fonte: Lu, Q., et al. Detectando migração e infiltração de neutrófilos em camundongos. J. Vis. Exp.(2020).

Este vídeo descreve o procedimento para gerar uma bolsa de ar no tecido subcutâneo de camundongos e coletar exsudatos inflamatórios em resposta à administração de lipopolissacarídeos in vivo. Este vídeo também cobre a análise da infiltração de neutrófilos na bolsa de ar.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Ensaio da bolsa de ar

Primeira injeção de ar
1. No dia 0, anestesiar totalmente os camundongos com isoflurano a 5% por 3 min em uma câmara de anestesia gasosa a uma velocidade de 2 L/min e manter a anestesia de cada camundongo em uma única unidade de respiração com isoflurano a 2% a uma velocidade de 0,5 L/min.
  nota: A profundidade suficiente da anestesia é garantida beliscando os dedos dos pés antes de mover os camundongos da câmara para a unidade de respiração única. As pernas não devem se mover quando os dedos dos pés são comprimidos.
2. Use um filtro de 0,22 μm conectado a uma seringa de 5 mL para obter um volume de 3 mL de ar esterilizado.
3. Levante a pele posterior do camundongo anestesiado com uma pinça e injete subcutaneamente 3 mL de ar esterilizado usando uma agulha de 26 G x 3/8".
4. Após o tratamento, remova os camundongos da unidade de respiração. Monitore os ratos para garantir que eles estejam vivos até que comecem a se mover.
Segunda injeção de ar
1. No dia 3, injete mais 3 mL de ar esterilizado na bolsa de ar previamente estabelecida para sustentar a bolsa de ar, conforme descrito na seção 1.1.
tratamento
1. No dia 6, 6 h antes do sacrifício, injete diferentes tratamentos na bolsa de ar. Injete 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) como controle negativo. Injete 1 mL de 1 μg / mL LPS como controle positivo para induzir inflamação local.
2. Anestesie totalmente os camundongos com isoflurano a 5% por 3 min em uma câmara de anestesia gasosa a uma velocidade de 2 L/min e mantenha a anestesia de cada camundongo em uma única unidade de respiração com isoflurano a 2% a uma velocidade de 0,5 L/min. Prepare o tampão de lavagem de acordo com a Tabela de Materiais.
  nota: A profundidade suficiente da anestesia é garantida beliscando os dedos dos pés antes de mover os camundongos da câmara para a unidade de respiração única. As pernas não devem se mover quando os dedos dos pés são comprimidos.
3. Para cada bolsa de ar, lave a bolsa de ar com 1 mL de tampão de lavagem e colete o exsudato inflamatório em um tubo de centrífuga de 15 mL. Lave a bolsa de ar com 2 mL de tampão de lavagem 2x e colete o exsudato inflamatório no mesmo tubo de centrífuga.
4. Centrifugue a 100 x g durante 10 min a RT. Elimine o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 ml de tampão de lavagem. Conte as células para quantificar a proporção de neutrófilos usando o analisador automático de hematologia.
  nota: Veja os resultados representativos na Figura 1.

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Resultados

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Figura 1: Resultados representativos do ensaio da bolsa de ar. (A) Ilustração do ensaio da bolsa de ar. (B) Resultados representativos da infiltração de subconjuntos de leucócitos no ensaio da bolsa de ar. PBS: controle; LPS: 1 μg/mL LPS. Os dados são apresentados como a média ± DP.