Quantificação da carga de Helicobacter pylori no estômago de um camundongo infectado

Resumo

Fonte: D'Costa, K. et al., Modelos de camundongos de infecção por Helicobacter e patologias gástricas. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para quantificar a carga de Helicobacter pylori em tecidos estomacais de camundongos pós-infecção para confirmar sua colonização.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Confirmação de colonização bacteriana no estômago pós-infecção

1. Contagem viável de H. pylori no estômago
   1. Suplemente as placas estéreis de HBA com antibióticos adicionais (200 μg / mL de bacitracina e 10 μg / mL de ácido nalidíxico) antes de realizar contagens de colônias de estômagos de camundongos infectados.
   2. Homogeneizar as seções do estômago manualmente, usando micropilões de polipropileno autoclaváveis ou usando um instrumento de dissociação mecânica (consulte a Tabela de Materiais).
   3. Preparar diluições seriadas duplicadas (10⁻¹ a 10⁻²) dos homogeneizados gástricos resultantes em BHI.
      estéril nota: As diluições devem ser decididas com base nas cargas bacterianas típicas obtidas para uma determinada estirpe de H. pylori utilizada para a infeção, bem como na duração da infeção. Amostras não diluídas também podem ser usadas.
   4. Divida as placas de HBA pré-secas (NOTA: Para garantir o isolamento de colônias individuais, as placas de HBA devem ser aquecidas e secas em uma cabine de segurança biológica ou incubadora a 37 ° C por 10 a 15 minutos antes do uso.) em três ou quatro segmentos. Usando uma adaptação da técnica de Miles e Misra, adicione 10-100 mL de cada diluição em um segmento da placa de ágar e espalhe usando alças de plástico estéreis.
   5. Deixe as placas secarem e coloque-as na posição invertida (com a tampa voltada para baixo) em frascos de gás anaeróbio. Para manter a umidade nos frascos, inclua uma placa de Petri contendo água.
   6. Incube os frascos a 37 °C até que as colônias se formem (normalmente 4–7 dias).
   7. Enumerar segmento(s) contendo entre 10 e 100 colônias isoladas.
      NOTA: As colônias de H. pylori e o crescimento de H. felis nas placas podem ser distinguidos daqueles de outros membros da microbiota gástrica murina usando testes padrão de urease, catalase e oxidase. H. pylori e H. felis são positivos para os três testes.
   8. Calcule as cargas bacterianas como (UFC/g de tecido), usando a seguinte fórmula:
      [(Número médio de colónias contadas) × (factor de diluição) x (volume em placa)]/(peso do estômago).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes bacteriológicos
Oxoid Blood Agar Base No.2	Thermo Fischer Scientific	CM0271B	Dissolver em água desinonizada antes da esterilização
Sangue de Cavalo Desfibrinado Premium	Produtos biológicos éticos australianos	PDHB100
Caldo de Infusão de Coração Bacto Brain	BD Biociência	Rolamento 237500	Dissolver em água desinonizada antes da esterilização
Pacotes de gás CampyGen	Thermo Fischer Scientific	CN0035A/CN0025A
Antibióticos
Vancomicina	Sigma Aldrich	V2002-1G	Dissolver em água deionizada
Polimixina B	Sigma Aldrich	P4932-5MU	Dissolver em água deionizada
Trimetoprima (≥98% HPLC)	Sigma Aldrich	T7883	Dissolver em 100% (absoluto) de etanol
anfotericina	Amresco (Astral Scientific)	E437-100MG	Dissolver em água deionizada
Bacitracina de Bacillus licheniformis	Sigma Aldrich	B0125	Dissolver em água deionizada
Ácido naladíxico	Sigma Aldrich	N8878	Dissolver em água deionizada
Equipamento e material de plástico
Frascos anaeróbicos oxóides	Thermo Fischer Scientific	HP0011/HP0031
Pipetas COPAN Pasteur	Serviços Interpath	200CS01
Centrífuga Eppendorf 5810R			Colete pellets bacterianos por centrifugação a 2.200 rpm por 10 minutos a 4 ° C
Parafilme M	Bemis, VWR	PM996
Micropilão Eppendorf para tubos de 1,2 - 2 mL	Sigma Aldrich	Z317314	Pilões de polipropileno autoclaváveis usados para homogeneização do estômago
Dissociador GentleMACs	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use um programa gentleMACS predefinido para tecido estomacal de camundongo
Tubos M (tampa laranja)	Miltenyi Biotec	30-093-236
Fluorômetro Qubit	Thermo Fischer Scientific	Pergunta 33216
Laço de plástico estéril	LabServ	LBSLP7202