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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de cateteres
- Preparar uma cânula pediátrica de acesso intravenoso para cada grupo de ratinhos a infetar. Usando o mecanismo de mola embutido, retire cada cânula de sua agulha, conforme as instruções do fabricante. Descarte as agulhas, preservando apenas a cânula intravenosa de plástico.
- Esterilize os cateteres em uma capela de fluxo laminar por um ciclo ultravioleta (UV), normalmente de 25 a 30 min.
Nota: Os cateteres podem ser usados para mais de um camundongo, no entanto, um novo cateter deve ser usado entre grupos experimentais, sexos ou cepas bacterianas.
2. Preparação de E. coli uropatogênica para infecção
- Pelo menos dois dias antes da infecção, usando uma alça de inoculação estéril, retire o UPEC de um estoque bacteriano congelado em uma placa de ágar Luria Broth (LB), contendo antibióticos, se apropriado. Incubar a 37 °C durante a noite. As placas podem ser armazenadas a 4 °C por até uma semana.
- Num erlenmeyer esterilizado de 100 ml, inocular 10 ml de LB, contendo antibióticos, se for caso disso, com uma única colónia da placa LB e incubar a 37 °C durante a noite (cerca de 16 - 18 horas).
Nota: As culturas em pé permitem a expressão de pili tipo 1, que são necessários para a infecção. Culturas cultivadas agitando terão expressão de pili menos eficiente e, portanto, taxas inconsistentes de infecção.
- Medir a densidade óptica (DO)600 da cultura noturna e calcular o número de bactérias por ml utilizando uma curva de crescimento pré-determinada. Por exemplo, para a cepa UPEC UTI89, OD600 = 0,35 é equivalente a 2 x 108 UFC por ml, portanto, uma cultura noturna com OD600 = 2,4 seria equivalente a 13,7 x 108 UFC por ml. Determinar empiricamente a relação entre o OD600 e bactérias viáveis com cada nova cepa empregada para infecção.
- Determinar a quantidade de bactérias necessária tendo em conta o número de animais a infectar e que cada ratinho deve receber cerca de 10a 7 unidades formadoras de colónias (UFC) em 50 μl de PBS. Incluir no cálculo o volume morto de ~130 μl do cateter e da seringa e 100 μl necessários para determinar o inóculo.
- Gire a suspensão bacteriana em uma microcentrífuga de mesa a 17.000 x g por 1 min e ressuspenda o pellet bacteriano resultante a 2 x 108 UFC por ml em PBS. Diluir em série uma alíquota desta suspensão e colocá-la em ágar LB, com antibióticos, se apropriado, para determinar o inóculo exacto para cada infecção.
- Aspire o inóculo bacteriano para uma seringa de 1 ml e encaixe o cateter na extremidade da seringa. Bata na seringa para remover qualquer ar e pressione o êmbolo para preencher o espaço de ar morto no cateter antes de iniciar a instilação.
3. Preparação de Ratos
- Anestesiar camundongos por meio de injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de cetamina e 5 mg/kg de xilazina. Calor suplementar pode ser fornecido.
- Certifique-se de que cada mouse esteja totalmente sedado apertando a almofada do pé com pressão média. Os camundongos são totalmente sedados quando não reagem e requerem de 3 a 5 minutos para atingir esse estado.
- Coloque os ratos em decúbito dorsal e aplique pressão média na parte inferior do abdômen para esvaziar a bexiga de urina. Bexigas cheias parecem uma ervilha sob a pele entre as cristas ilíacas.
Nota: O isoflurano inalado tem sido usado para cateterizar camundongos fêmeas, no entanto, não foi testado se os camundongos machos são suficientemente anestesiados por isoflurano inalado para este procedimento.
4. Instilação Transuretral de Camundongos Machos
- Coloque duas pinças de polegar cranial e caudalmente à genitália externa do camundongo. Retraia o prepúcio para expor totalmente a glande do pênis. Assim que o pênis estiver posicionado externamente, solte a pinça do polegar.
- Reposicione a pinça para estabilizar o pênis saliente perpendicular ao animal, segurando o órgão suavemente, mas esticado. Visualize o meato uretral e introduza cuidadosamente o cateter na pequena abertura na ponta do órgão. Guie suavemente o cateter para dentro do pênis, em direção ao corpo do mouse, mantendo uma tensão suave com a pinça. O cateter não requer lubrificação. Não force o cateter no pênis; O cateter deve deslizar suavemente para dentro da uretra, indicando o posicionamento correto.
- Assim que o cubo do cateter encontrar a ponta do pênis, dispense muito lentamente 50 μl do inóculo, mantendo a posição do pênis. A qualidade da instilação pode ser observada neste momento de acordo com um índice de qualidade de instilação predeterminado, como o mostrado na Figura 1.
- Retraia o cateter lentamente, contando até 5, para evitar vazamento do inóculo. Coloque os ratos em suas gaiolas em decúbito dorsal. Os animais devem começar a se recuperar 30 a 45 minutos após a administração do anestésico.
