Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de cateteres
- Preparar uma cânula pediátrica de acesso intravenoso para cada grupo de ratinhos a infetar. Usando o mecanismo de mola embutido, retire cada cânula de sua agulha, conforme as instruções do fabricante. Descarte as agulhas, preservando apenas a cânula intravenosa de plástico.
- Esterilize os cateteres em uma capela de fluxo laminar por um ciclo ultravioleta (UV), normalmente de 25 a 30 min.
nota: Os cateteres podem ser usados para mais de um camundongo, no entanto, um novo cateter deve ser usado entre grupos experimentais, sexos ou cepas bacterianas.
2. Preparação de Escherichia coli uropatogênica para infecção
- Pelo menos dois dias antes da infecção, usando uma alça de inoculação estéril, coloque Escherichia coli uropatogênica (UPEC) de um estoque bacteriano congelado em uma placa de ágar Luria Broth (LB), contendo antibióticos, se apropriado. Incubar a 37 °C durante a noite. As placas podem ser armazenadas a 4 °C por até uma semana.
- Num erlenmeyer esterilizado de 100 ml, inocular 10 ml de LB, contendo antibióticos, se for caso disso, com uma única colónia da placa LB e incubar a 37 °C durante a noite (cerca de 16 - 18 horas).
nota: As culturas em pé permitem a expressão de pili tipo 1, que são necessários para a infecção. Culturas cultivadas agitando terão expressão de pili menos eficiente e, portanto, taxas inconsistentes de infecção.
- Medir a densidade óptica (DO)600 da cultura noturna e calcular o número de bactérias por ml utilizando uma curva de crescimento pré-determinada. Por exemplo, para a cepa UPEC UTI89, OD600 = 0,35 é equivalente a 2 x 108 unidade formadora de colônias (UFC) por ml, portanto, uma cultura noturna com OD600 = 2,4 seria equivalente a 13,7 x 108 UFC por ml. Determinar empiricamente a relação entre o OD600 e bactérias viáveis com cada nova cepa empregada para infecção.
- Determine o número de bactérias necessárias considerando o número de animais a serem infectados e que cada camundongo deve receber aproximadamente 107 unidades formadoras de colônias (UFC) em 50 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Incluir no cálculo o volume morto de ~130 μl do cateter e da seringa e 100 μl necessários para determinar o inóculo.
- Gire a suspensão bacteriana em uma microcentrífuga de mesa a 17.000 x g por 1 min e ressuspenda o pellet bacteriano resultante a 2 x 108 UFC por ml em PBS. Diluir em série uma alíquota desta suspensão e colocá-la em ágar LB, com antibióticos, se apropriado, para determinar o inóculo exacto para cada infecção.
- Aspire o inóculo bacteriano para uma seringa de 1 ml e encaixe o cateter na extremidade da seringa. Bata na seringa para remover qualquer ar e pressione o êmbolo para preencher o espaço de ar morto no cateter antes de iniciar a instilação.
3. Preparação de Ratos
- Anestesiar camundongos por meio de injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de cetamina e 5 mg/kg de xilazina. Calor suplementar pode ser fornecido.
- Certifique-se de que cada mouse esteja totalmente sedado apertando a almofada do pé com pressão média. Os camundongos são totalmente sedados quando não reagem e requerem de 3 a 5 minutos para atingir esse estado.
- Coloque os ratos em decúbito dorsal e aplique pressão média na parte inferior do abdômen para esvaziar a bexiga de urina. Bexigas cheias parecem uma ervilha sob a pele entre as cristas ilíacas.
nota: O isoflurano inalado tem sido usado para cateterizar camundongos fêmeas, no entanto, não foi testado se camundongos machos são suficientemente anestesiados por isoflurano inalado para este procedimento.
4. Instilação Transuretral de Camundongos Fêmeas
- Usando a mão não dominante, coloque o polegar na cauda e um dedo da mesma mão no abdômen do mouse e aplique uma leve pressão em direções opostas para segurar o mouse firmemente no lugar.
- Coloque a ponta do cateter perpendicular ao camundongo no orifício uretral. Com uma leve pressão, deslize o cateter para dentro da uretra, até que o cubo encontre o orifício uretral, enquanto abaixa simultaneamente a seringa para que fique paralela à superfície de trabalho. O cateter não requer lubrificação. Não empurre ou force o cateter na uretra. O cateter deve deslizar suave e facilmente para dentro da uretra, com pouca ou nenhuma resistência.
- Antes de instilar o inóculo (etapa 4.3), uma vez que o cateter esteja no lugar, puxe suavemente a pele abdominal em direção à cabeça do camundongo com o dedo da mão não dominante que já está no abdômen do camundongo (etapa 4.1). Se o cateter estiver na uretra, o tecido que compõe o orifício da uretra não se moverá, enquanto se o cateter for colocado incorretamente na vagina, o tecido se moverá para cima e para longe do cateter. Este teste rápido deve ser realizado em cada camundongo.
- Quando o centro do cateter encontrar o orifício uretral, dispense lentamente 50 μl do inóculo bacteriano. Uma taxa de instilação lenta minimiza o refluxo vesicoureteral para o rim. Remova lentamente o cateter para evitar vazamentos, contando até 5. Coloque os ratos em suas gaiolas em decúbito dorsal.
