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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Análise por citometria de fluxo do tecido da bexiga
- Prepare o tampão de digestão contendo colagenase a 34 unidades / mL e DNase a 100 μg / mL, em PBS. Mantenha no gelo. Preparar um tubo cónico de 15 ml por animal a analisar e alíquota de 1 ml de tampão de digestão por tubo.
- Em pontos de tempo predeterminados, sacrifique camundongos usando procedimentos operacionais padrão aprovados (por exemplo, luxação cervical ou overdose de dióxido de carbono). Umedeça bem o abdômen com etanol 70% para minimizar a contaminação por pelos.
- Faça uma incisão no terço inferior do abdômen do camundongo de pelo menos 2 cm usando uma tesoura e remova toda a bexiga. Pique bem com uma tesoura, cortando a bexiga em pedaços de 2 a 3 mm detamanho 2, normalmente cerca de 8 pedaços.
- Adicione uma bexiga picada por tubo contendo tampão de digestão. Agite para lavar o tecido da bexiga picado no tampão de digestão. Mantenha no gelo até que todas as bexigas estejam dissecadas e picadas.
- Incubar bexigas picadas por 60 a 75 min a 37 °C, agitando vigorosamente com a mão por 5 s a cada 15 min. Quando o tecido tem uma aparência transparente vítrea, semelhante a papel de seda úmido, a digestão é completa. A digestão prolongada removerá as proteínas de superfície das células necessárias para a identificação e deve ser evitada.
- Inative as enzimas de digestão adicionando 2 a 3 mL de tampão de citometria de fluxo gelado (PBS contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) e 0,2 mM de EDTA) e misture suavemente. Coloque os tubos no gelo.
- Para garantir uma suspensão unicelular e remover qualquer tecido conjuntivo, passe o conteúdo do tubo através de um filtro de 100 μm colocado em um tubo cônico de 15 mL. Pressione suavemente qualquer tecido restante através do filtro com a extremidade de um êmbolo de seringa. Lave o filtro com um tampão de citometria de fluxo adicional de 2 ml. Mantenha as amostras no gelo.
- Lave as amostras por centrifugação por 7 min a 200 x g, 4 ° C. Ressuspenda os pellets em tampão de citometria de fluxo de 100 μL contendo o bloco Fc, diluído a 5 μg / mL, e transfira para uma placa de fundo redondo de 96 poços. Após 10 a 15 minutos, adicione 100 μL do coquetel de anticorpos desejado a cada amostra. Incubar amostras por 30 a 45 min, em gelo, protegidas da luz.
nota: O bloqueio Fc é um reagente usado para impedir a ligação da porção Fc dos anticorpos às células que expressam receptores Fc. Seu objetivo é minimizar a ligação inespecífica de anticorpos. A determinação dos anticorpos a serem usados dependerá da hipótese que está sendo testada no experimento e deve ser selecionada com a contribuição da literatura. Na Figura 1, para medir a infiltração geral das células imunes, foi empregado um anticorpo anti-CD45, que é uma proteína pan-imune das células.
- Lavar as amostras por centrifugação durante 7 min a 200 x g, 4 °C. Ressuspender os sedimentos em tampão de citometria de fluxo de 200 μL e passar as amostras através de um filtro de células de 40 μm num tubo de poliestireno de 5 ml imediatamente antes da aquisição num citómetro de fluxo.
- Recolha a amostra completa no citómetro de fluxo. Uma boa digestão produzirá de 200.000 a 400.000 células, com 8.000 a 10.000 células imunes CD45+ de bexigas de camundongos virgens, enquanto os órgãos infectados conterão mais células (Figura 1).
nota: As amostras preparadas para análise por citometria de fluxo não podem ser usadas para avaliar a UFC. Não é recomendado dividir a bexiga em duas partes, pois não existem evidências que demonstrem que a colonização uropatogênica de E. coli (UPEC) ou a infiltração de células imunes é uniforme em todo o tecido.
