Uma técnica para estabelecer um modelo de infecção bacteriana em uma cultura de órgãos ex vivo

Resumo

Fonte: Rizzuto, G. A., et al. Culturas de órgãos placentários e deciduais humanos para estudar infecções na interface materno-fetal. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra um método para estabelecer um modelo de infecção em tecidos placentários para estudar a propagação da infecção. Uma cultura de órgãos placentários ex vivo é infectada com Listeria monocytogenes, um parasita intracelular facultativo. As bactérias invadem trofoblastos extravilosos (EVTs) para entrar no tecido placentário e depois se propagam para outras células por meio da disseminação célula a célula.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Preparação de placas de cultura de órgãos

NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas usando técnica estéril em uma capa de cultura de tecidos. É ideal para o microscópio de dissecação ser localizado em um campo estéril. No entanto, isso não é absolutamente necessário, desde que a microdissecção seja realizada rapidamente e os instrumentos sejam mergulhados frequentemente em etanol a 70%.

1. Descongele o(s) frasco(s) de matriz extracelular (ECM) no gelo. Dilua o ECM 1:1 com meio de coleta gelado e misture por pipetagem. Pipete lentamente para evitar a introdução de bolhas. Cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços requer 100 μl dessa suspensão e acomodará 3-4 culturas de órgãos.
2. Coloque inserções transwell (tamanho de poro 0,4 μM) em cada poço da placa de cultura de tecidos de 6 poços.
3. Revestir cada inserto transwell com uma camada fina (100 μl) da suspensão ECM/meio.
4. Coloque a placa no gelo e proceda imediatamente ao estabelecimento das culturas de órgãos. Em alternativa, preparar a placa antes da colheita do tecido, caso em que envolvê-la em para-película e guardá-la a 4 °C para utilização posterior. O armazenamento por mais de 6 horas não é recomendado, pois o ECM secará.

2. Estabelecimento de Culturas de Órgãos

NOTA: Esta etapa descreve como colocar culturas de órgãos deciduais e culturas de órgãos vilosos em transwells separados. Os tecidos não estão em contato. Pesquisadores interessados em uma técnica de co-cultura onde decídua e vilosidades estão em contato direto entre si podem consultar a literatura anterior.

1. Enxágue as amostras duas vezes em meios de coleta e centrifugue a 1.000 x g entre cada enxágue. Transfira o tecido para uma placa de Petri estéril e coloque-o no palco de um microscópio de dissecação. Mantenha uma placa de 6 poços no gelo adjacente ao microscópio.
2. Microdissecar o tecido com tesoura e pinça de dissecação springer estéril, para estabelecer culturas de órgãos vilosos de 2-3 mm (Figura 1A).
   nota: As culturas de órgãos vilosos são pequenas "árvores" bem vascularizadas com 2 ou 3 ramos e com colunas de células trofoblásticas extravilosas (EVT) proeminentes. É importante utilizar apenas tecido viloso a partir de amostras do primeiro trimestre de <9 semanas, pois a invasão de trofoblastos extravilosos na MEC é mais pronunciada nessas idades jovens.
3. Selecione vilosidades bem vascularizadas com colunas de células EVT proeminentes. As colunas de células EVT são visualizadas como extremidades bulbosas, "difusas" e "fofas" (consulte as pontas das setas na Figura 1A).
4. Use uma pinça estéril para transferir 3 ou 4 árvores vilosas para cada transpoço. Ajuste os galhos para que a árvore fique posicionada plana sobre o ECM e separe os galhos agrupados.
5. Microdissecar o tecido decidual com tesoura e pinça de dissecação de springer estéril, para estabelecer culturas de 3 mm^{e 3} órgãos deciduais (Figura 1A).
   nota: Os espécimes contêm dois tipos distintos de tecidos deciduais, decidua parietalis e decidua capsularis (fragmentos de tecido esquerdo e direito, respectivamente, Figura 1A).
6. Apare com uma tesoura para criar 3 mm³ pedaços de decidua parietalis. Decidua capsularis não é usado para essas culturas. Use fórceps para remover qualquer sangue materno coagulado.
7. Use uma pinça estéril para transferir 3-4 pedaços de decídua para cada poço trans.
8. Adicione 1 ml de meio de coleta no fundo do poço. Incubar a placa durante a noite a 37 °C em 5% de CO₂.
9. Para experimentos em que é importante mimetizar a tensão normal de oxigênio placentário no primeiro trimestre, manter as culturas de órgãos vilosos em hipóxia relativa (3% O₂).
   nota: As opções de laboratório incluem pequenas câmaras de incubadora de hipóxia que se encaixam dentro das incubadoras existentes ou uma incubadora de três gases que introduz gás N₂ externo para reduzir a concentração de oxigênio.
10. Adicione 1 ml de meio viloso ou decidual (Tabela 1) no topo do transwell após 12-16 horas de cultura.
    nota: A ausência de meio durante a primeira noite na cultura permite que as colunas de células trofoblásticas extravilosas invadam (cultura de vilosidades) e que o tecido (viloso e decidual) fique firmemente embutido na MEC. Em nossa experiência, as culturas de órgãos deciduais permanecem viáveis por 72 horas e as culturas de órgãos vilosos por 96 horas. Recomendamos desfechos experimentais que se enquadrem nesse período de tempo. Consulte a Tabela 1 para a composição do meio Viloso e Decidual. O meio viloso tem uma alta porcentagem de FBS, enquanto o meio Decidual é suplementado com hormônios da gravidez (progesterona, 17β-estradiol) que mantêm o estado decidualizado (Tabela 1).

3. Preparação de culturas de L. monocytogenes

NOTA: Para um protocolo detalhado sobre o armazenamento a longo prazo de L. monocytogenes, e a cultura e crescimento deste organismo em caldo de infusão cérebro-coração (BHI) e ágar, consulte Wang et al.

1. Pegue uma única colônia de L. monocytogenes de uma placa de ágar BHI listrada e inocule 3 ml de caldo BHI.
2. Incubar a cultura de L. monocytogenes durante a noite (16 horas), em posição inclinada, a 30 °C.
   nota: Essas condições de cultura permitem que o crescimento bacteriano atinja a fase estacionária. L. monocytogenes é flagelada a 30 °C, o que aumenta a invasão da célula hospedeira.

4. Infecção de Culturas de Órgãos com L. monocytogenes

1. Solução salina tamponada com fosfato quente (PBS) e meio viloso ou decidual (Tabela 1) a 37 °C.
2. Use uma pinça estéril para remover quaisquer pedaços de cultura de órgãos que não invadiram a ECM e, portanto, estão flutuando no poço.
3. Aspire cuidadosamente o meio do fundo do transwell. Enxágue os transwells superior e inferior duas vezes, pipetando suavemente 1 ml de PBS quente no poço e aspirando cuidadosamente entre eles. Pipetar suavemente 1 ml de meio viloso ou decidual sem antibióticos para a camada superior e inferior. Tenha cuidado para não perturbar a cultura de órgãos.
4. Deixe o tecido incubar em meio livre de antibióticos por pelo menos uma hora para garantir que os antibióticos tenham sido removidos.
   nota: Na fase estacionária, a densidade da cultura de L. monocytogenes é de aproximadamente 1 x 10⁹ unidades formadoras de colônias (UFC) por ml. O número de bactérias usadas para infectar culturas de órgãos deve ser determinado empiricamente para atender às necessidades experimentais.
5. Para L. monocytogenes do tipo selvagem, experimentos de infecção de rotina mostram invasão robusta com uma diluição de 1:50 da noite para o dia (4 x 10,⁷ L. monocytogenes em 1 ml de meio por poço). Ressuspenda o número apropriado de bactérias em um meio viloso ou decidual sem antibióticos.
6. Aspire o meio do topo dos transwells. Adicione suavemente 1 ml de inóculo. Incubar as placas a 37 °C em 5% de CO₂ para permitir a invasão bacteriana.
7. Remova as bactérias extracelulares aspirando meios dos transpoços superiores e inferiores. Enxágue os poços duas vezes com PBS quente. Adicione 1 ml de meio viloso ou decidual suplementado com 50 μg ^ml-1 de gentamicina. Incubar placas a 37 °C em 5% de CO₂,
   NOTA: L. monocytogenes é uma bactéria intracelular facultativa que pode crescer em meio extracelular, crescer dentro das células e se espalhar de célula para célula sem acessar o espaço extracelular. A gentamicina tem um efeito bactericida sobre L. monocytogenes extracelulares e, portanto, permite a medição do crescimento e disseminação intracelular de L. monocytogenes através da cultura de órgãos.
   nota: A infecção reprodutível por L. monocytogenes de culturas de órgãos de vilosidades e decíduas ocorre com tempos de incubação de 5 horas. O tempo de incubação antes da adição de gentamicina pode ser modificado com base nas necessidades experimentais e na capacidade do organismo de invadir o tecido. Para entender melhor os locais anatômicos mais vulneráveis à infecção, tempos de incubação mais curtos podem ser usados.
8. Manter as placas a 37 °C a 5% de CO₂ durante a experiência. Altere toda a mídia em cada poço diariamente.
   nota: Em nossa experiência, as culturas de órgãos deciduais infectadas por L. monocytogenes permanecem viáveis por 48 horas e as culturas de órgãos vilosos por 72 horas.

Tabela 1: Receitas de mídia. Componentes e concentrações para preparação de tampão de lavagem, meio de coleta, meio viloso e meio decidual

Tampão de lavagem	Meio de coleção	Meio viloso	Decidual médio
Pbs	DMEM/F-12 com GlutaMAX	DMEM/F-12 com GlutaMAX	DMEM/F-12 com GlutaMAX
Penicilina 100 UI/ml	Soro fetal bovino 2,5%	Soro fetal bovino 20%	Soro fetal bovino 2,5%
Estreptomicina 100 μg/ml	Penicilina 100 UI/ml	Penicilina 100 UI/ml	17β-estradiol 300 pg/ml
Gentamicina 50 μg/ml	Estreptomicina 100 μg/ml	Estreptomicina 100 μg/ml	Progesterona 20 ng/ml
Anfotericina B 1,25 μg/ml	Gentamicina 50 μg/ml
	Anfotericina B 1,25 μg/ml

Resultados

Figura 1: Culturas de órgãos vilosos – Imagens macroscópicas e microscópicas representativas.

(A) Duas árvores vilosas terminais com idade gestacional de 6 semanas, vistas ao microscópio de dissecação. Observe as extremidades "fofas" (pontas de flechas) e a vasculatura fetal proeminente percorrendo os galhos da árvore à esquerda que tornam...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bolsas de esterilização	Fisher Científico	01-812-54	Para autoclavagem de ferramentas de dissecação individuais
Filtro de malha fina	Cuisinart (Amazon.com)	NA	Embrulhe completamente em papel alumínio e autoclave antes da coleta de tecidos.
Garrafão com torneira	Fisher Científico	03-007-647	Para preparação de grande volume de tampão de lavagem.
Bolsas de gelo	Laboratórios Nortech	GB8818	Eles não precisam ser comprados, mas podem ser reciclados/reutilizados de qualquer remessa de laboratório de rotina que os inclua na embalagem.
70% de etanol	VWR	V1001	Solução a 70% feita pela adição de dH20 a álcool de grau de pesquisa de 190 ou 200 provas.
10% de água sanitária	Waxie Abastecimento Sanitário	CLO 30966	Solução a 10% feita pela adição de dH20.
Caixa de luz	Litebox Lumina (dickblick.com)	Rolamento 55305-2009	Nota lâmpadas de reposição também compradas no Blick (55305.0100)
Micro pinça de dissecação	Stoelting	Rolamento 52102-43	4 pol., 1x2 0,5 mm, ligeira curva
Micro pinça de dissecação	Stoelting	Rolamento 52102-06	4in, reto fino, afiado
Tesoura de mola vannas de micro dissecação	Stoelting	Rolamento 52130-01P	Tesoura de mola McPherson-Vannas, 8,5 cm, ponta de 0,33, ligeira curva
Microscópio de dissecação	Leica Microsystems	MZ16 ou M60	Tivemos sucesso com os modelos listados. Fontes de luz flexíveis gooseneck externas são úteis, mas não necessárias.
Tubos cônicos de 50 mL	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS4558
Solução salina tamponada com fosfato	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10010023	Compramos de nossas instalações universitárias do Núcleo de Cultura de Tecidos, opções alternativas como esta estão disponíveis.
10X solução salina tamponada com fosfato	Teknova	Pág. 0195	Para a preparação do tampão de lavagem, usamos 10X PBS
Mistura de nutrientes DMEM/F-12 (Ham's) com GlutaMAX	Gibco (Tecnologias de Vida)	10565-018	Compramos esta formulação de meio específico, contendo 2,438 g/L de bicarbonato de sódio, 55 mg/L de piruvato de sódio e 4,5 g/L de glicose
gentamicina	Thermofisher Científico	15710072	Estoque 1000X. Recomenda-se preparar e armazenar alíquotas a -20 °C para evitar congelamento/descongelamento.
Penicilina/estreptomicina	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	Estoque 100X. Recomenda-se preparar e armazenar alíquotas a -20 °C para evitar congelamento/descongelamento.
Anfotericina B	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15290-018	Estoque 500X. Recomenda-se preparar e armazenar alíquotas a -20 °C para evitar congelamento/descongelamento.
progesterona	Sigma-Aldrich	Pág. 8783	Uma solução estoque de 1 mM é feita reconstituindo 15,7 mg de pó de progesterona em 15,7 mL de etanol e adicionando 34,3 mL de PBS. A solução é filtrada estéril, alíquota e armazenada a -20 °C.
17β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Uma solução estoque de 10 μM é feita reconstituindo 13,5 mg de pó de estradiol em 10 mL de etanol e adicionando 40 mL de PBS. A solução é filtrada estéril, alíquota e armazenada a -20 °C.
Filtro de vácuo de topo de garrafa (0,22 μm)	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS430769	Para filtração estéril de meios de coleta após a preparação
Placa de cultura de tecidos com 6 poços	Falcão BD	353224	Poliestireno, Tratamento para cultura de tecidos
Transwells de 6 poços	Millipore	PICM03050	Inserto - membrana de PTFE hidrofílico de 30 mm de diâmetro, tamanho de poro de 0,4 μm
Matriz extracelular (por exemplo, matriz matrigel)	BD Biociências	354234	Utilizamos a Matriz de Matrigel em nossos estudos. É um sólido à temperatura ambiente e a -20 °C. Evite congelar/descongelar repetidamente. Descongele o frasco até uma solução viscosa a 4 °C e prepare alíquotas de ~ 300μL na câmara fria com pontas de pipeta resfriadas. Armazenar alíquotas a -20 °C.
Paraformaldeído, solução aquosa a 16% p/v	Alfa Aesar	Rolamento 30525-89-4	Para a fixação do tecido, uma nova preparação de paraformaldeído a 4% é feita diluindo esse estoque em PBS.
Incubadora de cultura de tecidos, mantida a 37 °C, 5% de CO2, 3% de oxigénio (opcional para culturas de órgãos de vilosidades)			Para alguns experimentos, a hipóxia pode ser preferida. Isso pode ser estabelecido de várias maneiras, incluindo a adição de nitrogênio exógeno via cilindro de gás, tubulação Tygon e um regulador.
Centrífuga de bancada