Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
CUIDADO: Trabalhar com amostras de sangue humano e parasitas da malária humana requer medidas de precaução. Sempre use jaleco e luvas e trabalhe em um gabinete de biossegurança de nível 2. Em caso de exposição percutânea acidental à malária humana, informe a Saúde e Segurança para tratamento profilático. Considerações adicionais de segurança também devem ser implementadas para trabalhar com sangue HIV (+) do vírus da imunodeficiência humana. Use um jaleco com fechamento traseiro. Luva dupla (a luva superior deve ser de látex). Execute todo o manuseio em um gabinete de biossegurança de nível 2. Não use vidro ou objetos pontiagudos. Não use um aspirador. Coloque todos os itens contaminados em solução de virox ou alvejante por no mínimo 1 hora antes de descartá-los. Lave todas as superfícies com virox e ultravioleta (UV) por 1 hora após o uso. Observe que cada instituição terá seus próprios regulamentos específicos de biossegurança que precisam ser seguidos. Relate todas as exposições acidentais a sangue infectado pelo HIV à Saúde e Segurança para avaliação e consideração de possível profilaxia pós-exposição.
Nota: Existem diferentes cepas de parasitas da malária P. falciparum. O ITG foi usado para esses experimentos, mas diferentes cepas podem ser usadas. Excelentes instruções sobre congelamento e descongelamento de parasitas Plasmodium falciparum estão disponíveis no site do MR4.
1. Fazendo RPMI-A para cultura de parasitas da malária
- Faça RPMI-0 misturando 950 ml de água bidestilada (ddH2O), 1 pacote de pó do Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, 6 g de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfônico (HEPES), 2 g de bicarbonato de sódio e 1,35 mg de hipoxantina.
- Descongele o soro humano inativado pelo calor de dois doadores diferentes. Os doadores AB são os melhores, mas qualquer um pode ser usado se os parasitas forem cultivados em glóbulos vermelhos do tipo O (RBC). Inverta os tubos para misturar. Se o soro contiver partículas ou for espesso, gire a 2.000 rpm e, em seguida, filtre a porção líquida usando uma unidade de filtro de 0,45 μm.
- Usando uma unidade filtrante de 0,2 μm, filtre 180 ml de RPMI-0, 20 ml de soro humano (10 ml de cada doador) e 0,5 ml de 10 mg/ml de gentamicina.
nota: O soro humano pode entupir o filtro, portanto, mais de uma unidade de filtro pode ser necessária.
- Rotule o frasco médio com RPMI-A, a data e a fonte do soro. Leve à geladeira até que seja necessário. O RPMI-A pode ficar turvo quando refrigerado. Isso é normal, mas o aumento da nebulosidade é um sinal de contaminação.
nota: O crescimento do parasita pode variar em diferentes soros de doadores. É uma boa ideia testar todos os lotes de soro humano para um bom crescimento do parasita antes de usar.
2. Preparação de glóbulos vermelhos humanos para cultura de parasitas
Nota: Os doadores de sangue devem ser do tipo O.
- Colete 7-10 ml de sangue em tubos de ácido-citrato-dextrose (ACD). Escreva o ID do doador e a data de coleta no rótulo.
- Armazene sangue a 4 oC até que seja necessário. Use sangue para culturas de parasitas dentro de 1 mês.
- Limpe a parte superior do tubo com etanol a 70%. Remova cuidadosamente a rolha e descarte-a. Transfira o sangue para um tubo de 15 ml. Gire por 3 min a 1.000 x g. Remover o plasma por aspiração.
- Suspenda as hemácias com um volume igual de RPMI-0 quente. Gire por 5 min a 1.000 x g. Remova o revestimento leucocitário por aspiração, ressuspenda em 5 ml de RPMI-0 e repita a lavagem mais 2 vezes.
- Remova o sobrenadante e adicione RPMI-A suficiente para produzir uma mistura com 50% de hemácias em volume.
- Armazene a 4 oC até que seja necessário.
3. Manutenção de culturas de parasitas
- Pré-aqueça o RPMI-A a 37 oC.
- Coloque os parasitas descongelados (consulte o protocolo MR4 para procedimento de descongelamento) em um frasco T25 com 5 ml de RPMI-A e 75 μl de hemácias humanas lavadas para um hematócrito de ~ 3%. nota: O hematócrito mede o volume de hemácias em comparação com o volume total. Para calcular o hematócrito, meça o volume de concentrado de hemácias para o volume total de meio mais hemácias. Suponha que os parasitas descongelados contribuam com 75 μl de hemácias. Ao adicionar 150 μl de estoque de hemácias (o que equivale a adicionar 75 μl de concentrado de hemácias) ao frasco, há um total de 150 μl de hemácias em 5 ml de meio, o que equivale a um hematócrito de 3% (150 μl / 5.000 μl x 100% = 3%).
- Abastecer o balão durante 30 segundos com uma mistura de gases parasitas (1% O2, 3% CO2, equilíbrio N2). Fechar e colocar o balão com o lado largo voltado para baixo numa incubadora a 37 oC de modo a permitir a maior superfície de troca gasosa.
- Para trocar o meio e verificar se há parasitemia (precisa ser feito diariamente), mova cuidadosamente o frasco para não perturbar a camada de hemácias. Usando uma pipeta Pasteur estéril e desconectada, retire o meio de cultura sem perturbar a camada de sangue.
- Para verificar a parasitemia, remova uma amostra de 10 μl da camada de sangue, coloque-a em uma lâmina de vidro e, usando uma segunda lâmina de vidro, crie uma fina película de sangue. Deixe a lâmina secar.
- Colocar 4 ml de RPMI-A fresco no balão, misturar delicadamente o gás durante 30 segundos e colocá-los numa estufa a 37 °C.
- Pinte a lâmina usando o kit de coloração Hema3 de acordo com o protocolo do fabricante.
- Para uma coloração ideal, mergulhe as lâminas na solução de fixação por 10 segundos, na solução I por 10 segundos e na solução II por 30 segundos. Enxágue com água e deixe as lâminas secarem.
- Calcule a parasitemia contando o número de hemácias de Plasmodium falciparum, PfRBC (roxo escuro manchado) versus o número total de hemácias (corado de rosa). Conte um total de 300 células para garantir a precisão.
- Quando os parasitas atingirem uma parasitemia de 5%, expandir a cultura para um frasco T75, usando 40 ml de RPMI-A e 500 μl de hemácias.
4. Sincronização de parasitas
Nota: No dia anterior ao experimento, sincronize a cultura do parasita tratando-a com alanina. Apenas parasitas em estágio de anel e hemácias não infectadas sobreviverão a este tratamento. A sincronização de alanina lhe dará uma cultura de trofozoíto puro no dia seguinte, que pode ser usada nos experimentos de co-cultura. Certifique-se de começar com uma cultura de parasitas que contenha a maioria dos parasitas em estágio de anel.
- Prepare a solução de alanina misturando 8,01 g de alanina (300 mM) e 0,365 g de Tris (10 mM) em 300 ml de ddH2O. Leve o pH a 7,4. Esterilize o filtro usando uma unidade de filtro de 0,2 μm.
- Pré-aqueça a solução de alanina a 37 oC.
- Gire a cultura do parasita (5 min x 1.000 x g) e remova o meio.
- Ressuspenda o pellet em 19 volumes de solução de alanina (1 ml de hemácias embaladas para 19 ml de solução de alanina). Incube por 15 minutos em temperatura ambiente (RT).
- Centrifugação 5 min x 1.000 x g. Aspirar sobrenadante. Lave em RPMI-0 uma vez. Aspire o sobrenadante e ressuspenda em RPMI-A e ajuste o hematócrito para ~ 3%. Garrafa de gás e retorno a 37 oC.
nota: Para experimentos de co-cultura, é necessária uma parasitemia mínima de 5% de trofozoítos, com 10% de parasitemia considerada ideal.
5. Preparação de parasitas e hemácias para experimentos de co-cultura
- Use uma proporção de 3 PfRBC por PBMC em experimentos de co-cultura para induzir uma resposta inflamatória. Para calcular a PfRBC total, quantificar a parasitemia fazendo um esfregaço de sangue fino, conforme descrito em 3.5, e o hematócrito contando o número de hemácias por mL de cultura do parasita usando um hemocitômetro.
Número de PfRBC = % de parasitemia x eritrócitos totais/ml x ml de cultura. Por exemplo, 10 ml de cultura a 10 x 106 hemácias/ml e 10% de parasitemia é igual a 0,1 x 106/ml x 10 ml = 10 x 106 PfRBC.
- Gire a cultura do parasita por 5 min a 1.000 x g (RT). Aspirar o meio e ressuspender a 6 x 106 PfRBC por ml em RPMI-S+ (500 ml de RPMI-1640 suplementado com L-glutamina e HEPES, 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS), 1,5 ml de gentamicina, 5 ml de piruvato de sódio 100 mM, 5 ml de aminoácidos não essenciais MEM 10 mM, 5 ml de β-mercaptoetanol 5mM).
- Pegue o sangue de controle (hemácias não infectadas do mesmo doador usado para manter a cultura do parasita), calcule o hematócrito e ressuspenda em RPMI-S+ com o mesmo número de hemácias por ml que a cultura do parasita.
6. Isolamento de Células Mononucleares do Sangue Periférico Humano (PBMC)
- Colete sangue venoso em tubos de heparina sódica (topo verde) de um doador crônico de HIV(+) e de um controle de HIV(-). Não use ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) como anticoagulante, pois a ação quelante de cálcio do EDTA afeta a função celular. Em média, espere entre 5-10 x 106 PBMC por 10 ml de sangue. Para um experimento típico, colete 30 ml de sangue de cada doador. O volume de sangue precisará ser ajustado de acordo com os requisitos experimentais.
- O mais rápido possível e definitivamente dentro de uma hora após a coleta do sangue, remova o sangue dos tubos e coloque-o em um tubo de plástico de 50 ml. Os monócitos, em particular, serão ativados e aderirão ao vidro, por isso é importante que, se forem usados tubos de coleta de sangue de vidro, as células sejam removidas o mais rápido possível.
- Gire o sangue a 1.000 x g por 15 min e colete plasma (isso pode ser usado para outros estudos, se necessário - caso contrário, esta etapa pode ser ignorada). Dilua o sangue em um volume igual de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) fria.
- Colocar 15 ml de RT Ficoll num tubo de 50 ml. Lentamente, usando uma pipeta de transferência de plástico estéril, coloque a solução de sangue/DPBS sobre o Ficoll sem qualquer mistura. Um máximo de 25 ml de solução de sangue/DPBS pode ser colocado em camadas sobre cada 15 ml de Ficoll.
- Gire os gradientes por 30 min em RT a 600 x g. Certifique-se de que a configuração 'sem freio' esteja ativada.
- Depois que as células girarem, procure a interface entre as duas fases. É aqui que estão os PBMCs. Usando uma pipeta de transferência de plástico estéril, colete o PBMC da interface (veja a Figura 1). Minimize a contaminação por hemácias.
- Colocar as células recolhidas em tubos de 50 ml, com um máximo de 20 ml por tubo. Tubo superior até 50 ml com DPBS frio estéril.
- Gire as células por 10 min a 4 oC a 300 x g.
- Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 5 ml de DPBS frio estéril e agrupe todas as células do mesmo doador em um tubo. Complete até 50 ml com DPBS estéril e repita as etapas de lavagem mais 2 vezes.
- Ressuspenda as células em meio RPMI-S+ de 10 ml.
- Retirar uma alíquota de 20 μl e misturar com 20 μl de azul de tripano. Pipete 10 μl em um hemocitômetro e conte as células vivas (células que não absorveram o corante azul – todas as células azuis estão mortas). Use um hemocitômetro para calcular o número de células em uma solução da seguinte maneira.
nota: Um hemocitômetro possui uma grade de dimensões especificadas para que a área coberta pelas linhas seja conhecida.
- Certifique-se de que o hemocitômetro esteja limpo. Coloque a lamínula sobre a área de contagem. Carregue 10 μl de solução celular colocando a ponta da pipeta em um dos poços em forma de V. A área sob a lamínula será preenchida por ação capilar.
- Coloque o hemocitômetro carregado sob um microscópio. A grade completa do hemocitômetro contém 9 quadrados de 1 mm2 cada. Conte todas as células dentro de cada quadrado grande. Se houver muitas células, dilua ainda mais a solução e reconte.
- Calcule a concentração de células da seguinte forma: Total de células/ml = (total de células contadas/# de quadrados) x fator de diluição x 10.000 células/ml, por exemplo, (500 células/5 quadrados) x fator de diluição de 20 x 10.000 células/ml = 20 x 106 células no total.
- Ajustar o meio para uma concentração final de 10 x 10,6 por ml (meio RPMI-S+).
7. Cultura de coinfecção malária/HIV
- Placa de 100 μl de PBMCs isolados e 400 μl de meio RPMI-S+ para uma placa de 24 poços (1 x 106 PBMC por poço). Certifique-se de que os poços sejam instalados em triplicata: 3 poços para hemácias não infectadas, 3 poços com PfRBC, 3 poços com médio e 3 poços com PMA/Ionomicina. Isso é tanto para as amostras de HIV(+) quanto para HIV(-).
- Para os alvéolos de PfRBC, colocar 3 x 106 PfRBC em cada um dos alvéolos (500 μl de cultura de parasitas preparada em 5.2).
- Para os alvéolos de hemácias não infectados, colocar 500 μl da cultura de eritrócitos não infetados preparada em 5.3 em cada um dos alvéolos.
- Para poços médios, coloque 500 μl de meio RPMI-S+ em cada um dos poços.
- Para alvéolos de PMA/ionomicina, prepare a solução de PMA/ionomicina (2,5 pg/ml, 250 pg/ml, respectivamente). Colocar 500 μl desta solução em cada poço.
nota: Como estimuladores potentes da secreção de citocinas de células T, PMA e ionomicina são usados como controles positivos para garantir que as células sejam funcionais.
- Colocar a placa a 37 oC numa incubadora de CO2 a 5%.
- Opcional: use células excedentes para análise fenotípica usando citometria de fluxo ou armazene-as em uma solução de estabilização de RNA para futura análise de expressão de mRNA.
8. Detecção de respostas imunes à malária
Nota: Realize experimentos de co-cultura por até 4 dias. Nenhuma mudança de mídia é necessária durante esse período. O ponto de tempo ideal dependerá do tipo de célula de interesse e da pergunta feita. Uma incubação de 12-48 horas é ideal para respostas monocíticas a PfRBCs, enquanto as respostas de linfócitos foram melhor observadas em 72-96 horas. Os pontos de tempo precisarão ser otimizados com base na pergunta experimental. Períodos mais curtos (2-4 horas) podem ser usados se a interação entre PfRBC intacto e PBMCs for de interesse.
- Gire a placa a 300 x g por 3 min para pellet cells. Coletar 700 μl de sobrenadante de cultura de cada poço.
- Gire o sobrenadante a 1.000 x g por 5 min para limpar quaisquer detritos.
- Alíquota limpa sobrenadante conforme necessário, rotular e congelar a menos de -20 °C até que a análise dos fatores secretados seja realizada.
