Indução da doença do enxerto contra o hospedeiro em modelos de camundongos via transplante alogênico de medula óssea e células esplênicas

Resumo

Fonte: Buchele, V., et al. Indução da doença do enxerto contra o hospedeiro intestinal e sua avaliação mini-endoscópica em camundongos vivos. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra a indução da doença intestinal do enxerto contra o hospedeiro, GvHD, em um camundongo receptor letalmente irradiado usando células-tronco hematopoiéticas alogênicas e linfócitos T alorreativos esplênicos indutores de GvHD. Este protocolo ajuda a estabelecer um modelo de GvHD intestinal aguda grave para entender o mecanismo da doença e desenvolver opções terapêuticas inovadoras.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Indução da DECH

1. Dia 0: Irradiação corporal total dos camundongos receptores
   1. Use camundongos CD45.2 + H2kd + BALB/c fêmeas com pelo menos 10 semanas de idade como receptores.
   2. Pese e registre o peso dos camundongos receptores antes da indução da GvHD.
      nota: Certifique-se de que o destinatário tenha um peso corporal mínimo de 20 g. O peso corporal inicial servirá como valor de referência para calcular a perda de peso do camundongo individual ao longo da indução e progressão da GvHD.
   3. Coloque até cinco ratos no recipiente do irradiador de raios-X.
   4. Irradiar os camundongos por irradiação total do corpo com uma dose única de 8 Gy de raios-X. Use Cs137 como fonte de radiação.
2. Dia 1: Reconstituição dos camundongos irradiados com medula óssea depletada de células T
   nota: O transplante de células alogénicas da medula óssea, tal como descrito e descrito na secção 1.2, deve ser efectuado no prazo de 24 horas após a irradiação. Execute os procedimentos descritos abaixo em uma capa de cultura de tecidos estéril e use reagentes filtrados. Use CD45.1 / Ly5.1 B6 alogênico. Camundongos SJL-Ptprca Pepcb / BoyCrl como doadores de medula óssea empobrecida em células T.
   1. Eutanásia CD45.1/Ly5.1 B6. Camundongos SJL que doarão células alogênicas da medula óssea de acordo com as diretrizes institucionais, 12-24 h após a irradiação dos camundongos BALB/c receptores. Para isso, anestesiar o CD45.1/Ly5.1 B6. Camundongos SJL por inalação de isoflurano a 5%. Continue com a exposição ao isoflurano por mais de 1 minuto após a parada respiratória e confirme a eutanásia por luxação cervical.
   2. Desinfete bem o pelo e a pele do camundongo com etanol a 70%.
   3. Posicione o mouse em uma bainha de trabalho limpa de modo que o mouse fique em decúbito ventral, com os quartos traseiros voltados para o experimentador. Levante o pelo no calcanhar de Aquiles com a ponta da pinça Semken com comprimento de 13 cm e pontas curvas serrilhadas. Incisar a pele entre a pinça e o calcanhar com uma tesoura fina endurecida de 8,5 cm com pontas retas.
   4. Alongue a incisão cranialmente (ou seja, do calcanhar sobre a perna e coxa até a região do quadril). Remova a pele e o pelo do membro posterior com a ajuda da pinça.
   5. Execute o mesmo procedimento no outro membro posterior.
   6. Remova os membros posteriores cortando as articulações adjacentes do quadril.
   7. Corte as patas traseiras. Corte a articulação do joelho. Armazenar a coxa e a perna de cada membro posterior juntas em uma placa de Petri de 92 mm cheia de solução salina tamponada com fosfato (PBS) no gelo.
   8. Limpe os ossos do fêmur e da tíbia com cuidado, removendo o máximo de tecido muscular possível de cada coxa e perna. Transfira os ossos do fêmur e da tíbia para um tubo de 50 mL cheio de meio estéril RPMI 1640 e coloque-o em gelo úmido até que todos os ossos da tíbia e do fêmur coletados na etapa 1.2.7 sejam limpos do tecido muscular.
   9. Para isolar a medula óssea, transfira um fêmur ou osso da tíbia de cada vez (que foi limpo conforme descrito na etapa 1.2.8) do tubo de 50 mL para uma placa de Petri (com um diâmetro de 92 mm) preenchida com meio RPMI 1640. Corte as extremidades do fêmur ou tíbia com um bisturi para ter acesso à cavidade do osso que contém a medula óssea.
   10. Prepare um tubo de coleta de 50 mL com 5 mL de meio RPMI 1640. Insira uma agulha de 26 G conectada a uma seringa de 1 mL cheia de 1 mL de meio RPMI 1640 na cavidade óssea e lave a medula óssea para fora da cavidade para o tubo de coleta empurrando o êmbolo.
   11. Repita a etapa 1.2.10 até que o osso pareça claro e brilhante (ou seja, a cavidade óssea esteja visivelmente desprovida de medula óssea avermelhada). Descarte o osso vazio.
   12. Repita as etapas 1.2.9 - 1.2.11, usando todos os ossos do fêmur e da tíbia da etapa 1.2.8, e colete todos os pedaços de medula óssea recuperados no mesmo tubo de coleta de 50 mL da etapa 1.2.10. Mantenha o tubo de coleta em gelo úmido até que todos os ossos da etapa 1.2.8 tenham sido processados adequadamente.
   13. Crie uma suspensão de célula única pipetando suavemente os pedaços de medula óssea lavados e quebradiços para cima e para baixo. Filtrar a suspensão unicelular da medula óssea através de um filtro de células de tela de malha de 40 μm colocado num novo tubo de recolha de 50 ml.
   14. Centrifugar o tubo de colheita de 50 ml contendo a suspensão monocelular da medula óssea a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
   15. Ressuspenda o pellet em 5 mL de tampão de lise ACK (1 mM Na²EDTA; 10 mM KHCO₃; 144 mM NH₄Cl; pH 7,2) para lise de glóbulos vermelhos. Incubar a suspensão celular por 3 min em temperatura ambiente. Em seguida, adicione imediatamente 10 mL de solução de PBS à suspensão celular.
   16. Centrifugar a suspensão a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 ml de solução de PBS.
   17. Conte as células da medula óssea, usando um hemocitômetro. Conservar uma alíquota de 6 x 10⁶ células para análise por citometria de fluxo, a fim de verificar a pureza das células após a purificação celular (ver passo 1.2.20).
   18. Para a depleção de células T da suspensão unicelular da medula óssea, use um kit de purificação celular disponível comercialmente. Esgotar magneticamente as células CD90.2+ (ou seja, linfócitos) do total de células da medula óssea, seguindo o protocolo do fabricante.
   19. Conte as células da medula óssea depletadas de células T que foram isoladas conforme descrito na etapa 1.2.18, usando um hemocitômetro. Conservar uma alíquota de 1 x 106 células para análise por citometria de fluxo a realizar posteriormente, conforme descrito no passo 1.2.20.
       nota: O rendimento celular médio derivado de um camundongo doador é geralmente de 2 x 107 a 3,4 x 107 células da medula óssea depletadas de células T.
   20. Confirme uma depleção bem-sucedida de células T por citometria de fluxo. Corar 1 x 10⁶ células, preservadas das etapas 1.2.17 (células da medula óssea antes da separação magnética das células) e 1.2.19 (células da medula óssea depletadas de células T após separação magnética das células), com os seguintes anticorpos: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) e α-CD8α (53-6.7). Utilizar as células restantes do passo 1.2.17 como controlo não corado e para controlos de coloração única, para configurar o citómetro de fluxo.
       1. Transfira 1 x 10⁶ células de cada amostra para um poço de uma placa de 96 poços com fundo em V para realizar o procedimento de coloração por citometria de fluxo.
       2. Centrifugar as células dentro da placa de 96 poços (passo 1.2.20.1) a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 μL de tampão FACS (PBS suplementado com soro bovino filtrado a 3%).
       3. Centrifugar as células dentro da placa de 96 poços a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante.
       4. Adicione uma quantidade apropriada do anticorpo de escolha (compare com a etapa 1.2.20) às amostras para coloração única em 100 μL de tampão FACS.
       5. Preparar uma mistura de todos os anticorpos (master mix) contendo as quantidades adequadas suficientes para corar separadamente as alíquotas das células da medula óssea preservadas da depleção magnética das células T anteriores (ver passo 1.2.17) e posterior (ver passo 1.2.19). Adicione 100 μL da mistura principal a ambas as alíquotas.
       6. Adicione apenas 100 μL de tampão FACS à amostra não corada.
       7. Incubar as células dentro da placa de 96 poços durante 20 min a 4 °C na escuridão.
       8. Adicionar 100 μL de tampão FACS e centrifugar as células dentro da placa de 96 poços a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 μL de tampão FACS.
       9. Centrifugar as células a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 250 μL de tampão FACS.
       10. Transferir as amostras para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml e analisá-las com um instrumento citómetro de fluxo capaz de detectar as moléculas fluorescentes que foram utilizadas para marcar os anticorpos utilizados para caracterizar as amostras de células (ver passo 1.2.20).
       11. Compare a composição celular de antes e depois da separação magnética da célula.
           nota: Uma pureza de aproximadamente 95% de células CD45.1 + CD3- (ou seja, medula óssea empobrecida em células T) dentro do portão vivo é geralmente alcançada.
   21. Lave as suspensões de células da medula óssea empobrecidas de células T 2x com solução de PBS (450 x g por 5 min a 4 ° C) e, finalmente, ressuspenda as células em solução de PBS, ajustando a concentração celular para 5 x 10⁷ células / mL. Mantenha as células em gelo úmido até a injeção.
   22. Injetar células da medula óssea empobrecidas de células T nos ratinhos recetores, que foram irradiadas no dia anterior (ver secção 1.1).
       1. Coloque o camundongo experimental em uma câmara à prova de vazamentos e induza a anestesia por inalação de até 4% de isoflurano, até que o camundongo fique inconsciente. Confirme a analgesia e a perda de consciência testando a perda do reflexo de endireitamento e a subsequente perda do reflexo de retirada do pedal.
       2. Injete 5 x 10⁶ células da medula óssea depletadas de células T (ou seja, 100 μL de 5x10⁷ células / mL) contendo solução de PBS usando uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de 30 G por via intravenosa no espaço retrobulbar contendo o seio venoso.
3. Dia 2: Transferência de células T
   nota: Execute os procedimentos descritos abaixo em uma capa de cultura de tecidos estéril e use reagentes filtrados. Use CD45.2 C57Bl/6 (tipo selvagem; WT) como doadores de células T alorreativas. O uso de sistemas de marcadores congênitos permite a distinção entre os tipos de células hematopoiéticas receptoras (CD45.2+ H2kd+ Balb/c) e doadoras (células da medula óssea: CD45.1+ H2kb+ B6). Camundongos SJL; células T alogênicas: camundongos CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6).
   1. Eutanasiar camundongos C57Bl/6 de acordo com as diretrizes e autoridades institucionais aplicáveis. Portanto, anestesiar camundongos por inalação com uma concentração de 5% de isoflurano. Continuar a exposição ao isoflurano até 1 min após a parada respiratória e confirmar a eutanásia por luxação cervical. Desinfete bem o pelo e a pele do camundongo com etanol a 70%.
   2. Coloque um filtro com uma tela de malha de 40 μm em um tubo de coleta de 50 mL. Remova o baço e coloque-o na peneira.
   3. Com um êmbolo de seringa, retire o baço da peneira. Lave o filtro e o êmbolo da seringa com PBS para coletar todos os esplenócitos.
   4. Centrifugue as células dentro do tubo de coleta de 50 ml a 450 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
   5. Ressuspenda os esplenócitos em 3 mL de tampão de lise ACK para lisar os glóbulos vermelhos. Incubar a suspensão celular por 3 min. Em seguida, adicione 10 mL de PBS e centrifugue as células a 450 x g por 5 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os esplenócitos em PBS.
   6. Conte as células do baço, usando um hemocitômetro. Desviar uma alíquota de 6 x 10⁶ células para a análise por citometria de fluxo, a fim de avaliar a amplitude da purificação na etapa 1.3.9.
   7. Para um isolamento total de células T CD3+ de esplenócitos totais, use um kit de purificação celular disponível comercialmente. Isole as células T esplênicas, seguindo o protocolo do fabricante.
   8. Conte as células T CD3+ esplênicas isoladas conforme descrito na etapa 1.3.7, usando um hemocitômetro. Preservar uma alíquota de 1 x 10⁶ células T para análise de citometria de fluxo.
      nota: O rendimento médio de células T esplênicas por camundongo doador isolado por separação magnética de células varia de 1,3 x 10⁷ a 2 x 10⁷ células.
   9. Confirme o sucesso do isolamento de células T por citometria de fluxo. Para obter uma descrição detalhada do protocolo de coloração, confira e siga as etapas 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Corar 1 x 10⁶ esplenócitos das etapas 1.3.6 (antes da separação da célula magnética) e 1.3.8 (após a separação da célula magnética) com os seguintes anticorpos: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) e α-CD8α (53-6.7).
      2. Utilizar as células restantes do passo 1.3.6 como controlo não corado e para uma coloração única com os respectivos anticorpos, para configurar o citómetro de fluxo.
      3. Compare a composição celular antes e depois da separação magnética da célula.
         nota: Deve ser alcançada uma pureza de ≥95% das células T CD45.2+CD3+ dentro da porta viva dos linfócitos.
   10. Lave as células T 2x com PBS (450 x g por 5 min a 4 ° C) e, finalmente, ressuspenda as células em solução de PBS, ajustando a concentração celular para 7 x 10⁶ células / mL. Mantenha as células congeladas até a injeção.
   11. Injetar células T esplênicas aloreativas (ver passo 1.3.10) em ratinhos BALB/c irradiados que tenham recebido anteriormente células da medula óssea com depação de células T CD45.1+ (ver passo 1.2.22).
       1. Induza a anestesia colocando o camundongo experimental em uma câmara à prova de vazamentos na qual ele é exposto a até 4% de isoflurano até perder a consciência. Confirme a analgesia e a perda de consciência testando a perda do reflexo de endireitamento e a subsequente perda do reflexo de retirada do pedal.
       2. Injete 0,7 x 10⁶ células T CD3+ alorreativas usando uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de 30 G (ou seja, 100 μL de 7 x 10⁶ células/mL) contendo solução de PBS (ver etapa 1.3.10), por via intravenosa no espaço retrobulbar dos camundongos, para induzir GvHD. Denomine esses camundongos como o grupo experimental.
       3. Injetar um grupo diferente de camundongos com 100 μL de PBS sozinho, por via intravenosa no espaço retrobulbar, e denominar esse grupo como o grupo controle, posteriormente chamado de "camundongos transplantados sem células T (noT)".

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Irradiador gama BIOBEAM 2000	Gamma-Service Meical GmbH
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich Co. LLC. (em inglês).	D8662-6x500ML
Pinça Semken (comprimento: 13 cm; pontas serrilhadas e curvas)	Ferramentas de Belas Ciências	11009-13
Tesouras finas endurecidas (comprimento: 8,5 cm; pontas retas; aresta de corte: 24 mm)	Ferramentas de Belas Ciências	14090-09
RPMI-1640 Médio	Sigma-Aldrich Co. LLC. (em inglês).	R8758-500ML
Agulha hipodérmica (26G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
Seringa de 1 ml	B. Braun Melsungen AG	Rolamento 9166017V
Tubo de 50 mL	Sarstedt Ag & Co.KG	6,25,47,254
Filtro de células com tela de malha de 40 μm	Falcão BD	Rolamento 352340
Seringa de insulina com interior estéril (30G)	Bd	324826
Kit de isolamento de células T Pan II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	separação de células magnéticas para isolar células T esplênicas
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	separação de células magnéticas para isolar células da medula óssea depletadas de células T
Pinça de biópsia	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	Parte da configuração experimental para colonoscopia
Sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético di-hidratado (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingrediente do tampão de lise ACK
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Anticorpo (clone: 104; lote: B252126; RRID: AB_493731)	Biolenda	109822
Anticorpo anti-camundongo CD45.1 PE/Cy7 (clone: A20; lote: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolenda	Rolamento 110730
Anticorpo anti-camundongo APC/Cy7 CD8a (clone: 53-6.7, lote: B247008; RRID: AB_312753)	Biolenda	100714
Forano / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Soro bovino filtrado	Pan Biotec	Pág. 40-47500	ingrediente do buffer FACS