1. Purificação in vitro de esporozoítos de oocistos de C. parvum
- Purifique os esporozoítos dos oocistos de C. parvuapós branquear e lavar o alvejante conforme descrito acima.
- Transfira os oocistos para um tubo de 15 mL. Ressuspender oocistos em meio de excistação à temperatura ambiente (taurocolato de sódio a 0,75% p/v em DMEM) para obter 1 x 107 oocistos/mL. A adição de taurocolato melhora a taxa de excistação dos oocistos, melhorando o rendimento de esporozoítos.
- Incubar a suspensão de oocistos a 37 °C por 1–1,5 h.
- Verifique a amostra microscopicamente quanto à extensão da exciestação; 60-80% de excistação é razoável para uma boa recuperação de esporozoítos. Se o nível de excistação for baixo, incubar por mais tempo (mais 30 min a 1 h).
- Determine a porcentagem de excistação em relação ao número de oocistos iniciais. A excistação é calculada como:
% de excistação = [1 – (número de oocistos intactos/número de oocistos no início)] x 100
- Lave as células para remover os reagentes de excistação adicionando 14 mL de PBS ou meio, misturando e recuperando células (oocistos intactos, conchas de oocistos e esporozoítos) por centrifugação a 3.400 x g por 20 min para recuperar esporozoítos. Aspire cuidadosamente para evitar a perda de células.
- Ressuspenda o pellet de esporozoíto em 1–2 mL de DMEM para obter 3 x 107 oocistos/mL (com base no número de oocistos iniciais).
- Para remover os oocistos e conchas restantes, filtrar a suspensão através de um filtro de 3 μm (figura 1B). Utilizar um suporte de filtro de 47 mm equipado com um filtro de policarbonato (tamanho de poro de 3 μm) ligado a um corpo de seringa de 10 ml. Coloque o aparelho porta-filtro em cima de um tubo de 15 mL. Coloque o conjunto em um balde de gelo ou em uma câmara fria.
- Adicione 7,5 mL da suspensão de esporozoíto ao conjunto do filtro e deixe-o filtrar por gravidade. Lave com mais 7,5 mL de DMEM.
nota: Para garantir o sucesso no isolamento de esporozoítos, oocistos frescos e boa excistação são críticos. Se houver muitos oocistos não excistados, a suspensão não fluirá por gravidade. Aplicar pressão na seringa pode forçar a passagem de oocistos não excistados. A microinjeção de esporozoítos é mais desafiadora do que a de oocistos porque os esporozoítos podem se aglomerar e bloquear o capilar. Para evitar isso, recomendamos fazer uma ponta capilar mais larga ao injetar esporozoítos em organoides. Para atingir níveis suficientes de infecção, 2 a 4 vezes o número de esporozoítos precisa ser injetado em cada organoide em comparação com organoides infectados com oocistos.
- Centrifugue a suspensão de esporozoítos filtrados a 3.400 x g usando um rotor de balde oscilante por 20 min para pellet de esporozoítos.
- Ressuspender em 50–100 μL de meio de cultura organoide OME ou OMD (consulte a Tabela de Materiais) suplementado com corante Fast Green a 0,05% (p/v) e L-glutationa, betaína, L-cisteína, ácido linoleico e tampão redutor contendo taurina (consulte a Tabela de Materiais).
nota: A incubação de oocistos por muito tempo pode resultar na lise de esporozoítos e má recuperação e, portanto, deve ser evitada.
2. Cultura in vitro de intestino humano para microinjeção
- Cultura de organoides intestinais em condições de meios de expansão e diferenciação.
NOTA: Os detalhes da propagação intestinal foram descritos anteriormente em outros artigos (consulte a Tabela de Materiais para receitas de mídia). Aqui, descrevemos brevemente o método de cultura organoide com referência específica à otimização para injeção e crescimento de Cryptosporidium. Descobrimos que, para imagens de parasitas em organoides, os organoides cultivados em meio de expansão são preferíveis aos cultivados em meios de diferenciação, pois há menos acúmulo de detritos do que o observado em organoides cultivados em meio de diferenciação. No entanto, se o objetivo é isolar oocistos, os organoides cultivados em meios de diferenciação produzem um número muito maior de oocistos.
- Mantenha organoides em culturas 3D em matriz extracelular (consulte a Tabela de Materiais) a 37 ° C. Adicione OME (mídia de expansão organoide) por cima e atualize todos os dias.
- Para dividir e colocar organoides em placas para microinjeção, remova a mídia da placa de 6 poços contendo organoides humanos, adicione F12+++ (consulte a Tabela de Materiais) ao poço e quebre a matriz pipetando com uma ponta de pipeta de 1 mL várias vezes. Colete as células em um tubo de 15 mL (2 mL de F12+++ por tubo são suficientes para procedimentos posteriores).
- Adicione 10–12 mL de F12+++ em outro tubo de 15 mL e coloque uma pipeta de vidro polido a fogo no meio, pipete para cima e para baixo 3 vezes para quebrar os organoides intestinais humanos.
nota: Use uma tubulação de vidro longa (20–30 cm) e polir com fogo brevemente. Não faça a abertura (1 mm de diâmetro) muito pequena, pois os organoides podem ser danificados. Alise a ponta da pipeta polindo-a brevemente. Quebre os organoides em pedaços menores de ~ 50 μm.
- Adicione F12+++ até 5–7 mL e centrifugue a 350 x g por 5 min.
nota: A velocidade de centrifugação nesta etapa é maior do que o normal para fazer um bom pellet celular que esteja bem separado da matriz extracelular (consulte a Tabela de Materiais). Observamos que, em comparação com os organoides do intestino delgado de camundongos, os organoides do intestino delgado humano são mais difíceis de interromper.
- Remover o máximo de meio possível sem perturbar as células e, em seguida, ressuspender o pellet com a matriz mantida a 4 °C; são necessários 200 a 300 μL de matriz por alvéolo de uma placa de seis poços. Os organoides devem ser divididos um em cada três para manter uma densidade celular bastante alta.
- Plaquear os organoides em gotículas de matriz de cerca de 5 a 10 μL cada no poço de uma placa de seis poços. Incube por 20–30 min a 37 °C e, em seguida, adicione meio de expansão (OME) por cima.
- Troque o meio a cada 2–3 dias.
nota: Em cerca de 5 a 7 dias, os organoides que crescem em EM atingem um tamanho de 100 a 200 μm e estão prontos para injeção.
- Para diferenciar os organoides, após 5 a 6 dias no EM, mude o meio para condições de meio de diferenciação (DM) e mantenha-o por mais 5 a 6 dias antes de injetar os parasitas.
nota: Para expansão de organoides, recomenda-se revestir os organoides densamente. Para microinjeção, recomenda-se o uso de uma placa de seis poços com organoides plaqueados em menor densidade. Por exemplo, organoides de placa de três poços de uma placa de seis poços em uma placa completa de seis poços para microinjeções. A matriz deve ser mantida a -20 °C para armazenamento de longo prazo e descongelada a 4 °C ou no gelo antes do uso.
3. Microinjeção de oocistos/esporozoítos no lúmen organoide
- Microinjetar parasitas no lado apical do organoide 3D (Figura 2).
- Prepare capilares de vidro de 1 mm de diâmetro usando um extrator de micropipeta.
nota: As configurações usadas no extrator de micropipeta (consulte a Tabela de Materiais) são Calor = 663, Tração = 100, Velocidade = 200, Tempo = 40 ms. As configurações precisarão ser ajustadas de acordo com as instruções do usuário para uma máquina específica.
- Corte a ponta do capilar com uma pinça. O tamanho/diâmetro da extremidade capilar mede cerca de 9–12 μm; Isso permite o fluxo fácil de oocistos (tamanho de 4 a 5 μm).
- Encha os capilares com suspensão de oocistos ou esporozoítos usando pontas de microcarregadeiras.
- Carregue o capilar cheio de oocistos em um microinjetor.
- Microinjete suspensão de 100 a 200 nL em cada organoide sob um microscópio invertido com ampliação de 5x, mantendo a pressão constante. Após a microinjeção, atualizar o meio com OME ou OMD (meio de diferenciação organoide) todos os dias e manter a placa a 37 °C.
nota: Não usamos um micromanipulador para microinjeção. O uso do mesmo capilar é recomendado para todo o experimento para garantir uma injeção igual em todas as amostras.
