Geração de um modelo de camundongo de malária cerebral experimental usando esporozoítos derivados de mosquitos hospedeiros

Abstract

Fonte: Hoffmann, A. et al., Rastreamento in vivo do desenvolvimento de edema e patologia microvascular em um modelo de malária cerebral experimental usando ressonância magnética.J. Vis. Exp.(2017)

Este vídeo demonstra a geração de um modelo experimental de camundongo com malária cerebral. Esporozoítos isolados de mosquitos fêmeas infectados com Plasmodium berghei são injetados nas veias da cauda de um camundongo contido, levando à ruptura da barreira hematoencefálica e inflamação cerebral, causando malária cerebral. Este modelo de camundongo infectado oferece uma ferramenta valiosa para estudar a patologia microvascular in vivo associada à malária cerebral.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Infecção

1. Infecte mosquitos Anopheles stephensi com Plasmodium berghei ANKA, alimentando-os por 15 min em um camundongo gametocitêmico. Mantenha os mosquitos infectados a 80% de umidade e 21 °C.
2. Colete mosquitos fêmeas de sua gaiola 17 a 22 dias após a refeição de sangue. Coloque-os no gelo para anestesiá-los.
3. Usando uma pinça, coloque de três a quatro mosquitos em uma lâmina de vidro coberta com uma gota de meio RPMI frio. Coloque a lâmina sob um microscópio.
4. Usando uma pinça, estique cuidadosamente o mosquito entre a cabeça e o corpo. Isole a glândula salivar usando uma seringa e uma agulha. Repita este procedimento com os mosquitos restantes.
5. Colete as glândulas salivares da lâmina de vidro sugando-as com uma pipeta de vidro e coletando-as em um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
   nota: Dependendo das taxas de infecção, geralmente 8.000 a 15.000 esporozoítos infecciosos podem ser obtidos por glândula salivar.
6. Por aproximadamente 3 min, esmague as glândulas salivares isoladas dentro do tubo de centrífuga com um pequeno bastão de plástico para isolar os esporozoítos do tecido da glândula salivar.
7. Centrifugue por 3 min a 1.000 x g e 4 ° C para purificar os esporozoítos do tecido restante.
8. Pipete o sobrenadante, que contém os esporozoítos (SPZ), para um novo tubo de centrífuga e conte os esporozoítos purificados em um hemocitômetro Neubauer.
9. Ajuste a concentração de esporozoítos purificados para 10.000/mL adicionando solução salina tamponada com fosfato.
10. Injete um total de 1.000 esporozoítos (0,1 mL) nas veias da cauda de camundongos C57BL / 6 endogâmicos para iniciar a infecção. Para facilitar as injeções, coloque os camundongos C57BL / 6 em um limitador e coloque as caudas em água morna (aproximadamente 37 ° C) para auxiliar na visualização das veias da cauda.
    nota: A injeção em si é um procedimento curto que pode ser realizado em poucos segundos.
11. Uma vez ao dia, verifique a parasitemia do estágio sanguíneo em esfregaços sanguíneos a partir do dia 3 após a infecção por SPZ.
12. Avalie os camundongos uma vez ao dia com a pontuação da Escala de Coma e Comportamento Murino Rápido (RMCBS), a partir do dia 5 após a injeção de esporozoíto.
13. Avalie os camundongos com ressonância magnética (MRI) de acordo com a pontuação da Escala de Coma e Comportamento Murino Rápido (RMCBS) e a questão de pesquisa a ser abordada.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurano	Baxter	1001747	para anestesia
Dotarem	Guebert	1086923	Agente de contraste Gd-DTPA; 0,5 mmol / ml
Amira (Programa de Processamento de Imagens)	Grupo FEI		Versão Amira 5.3.2
LABORATÓRIO MATLAB	A MathWorks, Inc.,		Versão 2012b
Caixa de ferramentas FDT	Biblioteca de software do FMRIB