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Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Macrófagos da lavagem broncoalveolar (LBA)
- Usar LBA para obter macrófagos pulmonares em (1) seres humanos por broncoscopia e (2) camundongos por aspiração intratraqueal.
nota: A aquisição dos macrófagos geralmente causa alguma ativação dessas células. Os macrófagos são obtidos de pacientes que necessitam de uma broncoscopia para investigar um possível problema médico e nem todos os indivíduos podem ser adequados para análise de armadilhas extracelulares de macrófagos, ou METs (isso precisará ser determinado para cada projeto individual).
- Pegue a solução de LBA e gire-a para baixo (500 x g por 10 min) para formar um pellet, lave duas vezes com meio de cultura (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) com 5% de soro fetal de bezerro e 1% de L-glutamina) à temperatura ambiente e, em seguida, dilua as células em 4 mL de meio de cultura.
- Se necessário, solicite uma contagem diferencial formal; a maioria das células (geralmente >80%) serão macrófagos.
nota: Isso geralmente será realizado por um serviço de histologia clínica usando a aparência morfológica dos diferentes tipos de células.
- Realize uma contagem de células de macrófagos viáveis na solução de LBA usando exclusão de azul de tripano e um hemocitômetro.
nota: A solução de LBA é obtida de humanos e camundongos, conforme mencionado na etapa 1.1.
- Adicione 1 - 4 x 105 macrófagos a placas de 24 poços em lamínulas em 500 μL de meio de cultura por poço e deixe durante a noite a 37 ° C; as células aderirão às lamínulas. Para amostras humanas, adicione antibióticos (por exemplo, penicilina e estreptomicina, 104 U / mL) para evitar a contaminação bacteriana.
2. Marcação por imunofluorescência/microscopia de macrófagos de LBA
NOTA: As células são aderidas às lamínulas conforme mencionado acima.
- Remova o meio de cultura e lave as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Fixe as células em fixador de paraformaldeído/periodato/lisina (PLP) a 2% por 10 min.
- Lave as células brevemente em PBS e, em seguida, permeabilize em 0,2% Tween 20 em PBS por 20 min.
- Células de bloqueio com soro de galinha a 10% em albumina de soro bovino (BSA) a 5% diluída em PBS por 30 min.
- Incubar com anticorpos de controle primário e isotípico por 1 h à temperatura ambiente em concentrações de 1:100 (detalhes mais específicos estão listados na Tabela de Materiais) a 37 °C.
nota: Para as amostras de LBA, geralmente não é necessário um marcador específico de macrófagos.
- Após a adição de anticorpos primários, lave as células em PBS e incube com os anticorpos secundários correspondentes por 40 min em temperatura ambiente.
- Lave as seções em PBS e monte com um meio de montagem baseado em DAPI para visualização usando um microscópio confocal (como mencionado acima) em excitações a laser 405, 488, 561 e 647 nm e uma objetiva de óleo de 40X, 1.0 NA.