1. Inoculação por pulverização com suspensão de conídios de M. grisea
- Cultura fúngica para M.grisea
- Prepare o meio de cultura de ágar tomate aveia (OTA) para cepas de fungos.
- Pesar 30 - 50 g de aveia, adicionar a 800 mL de água destilada/deionizada (ddH2O) e ferver a mistura durante 30 min na panela elétrica.
- Filtre o suco de aveia fervido no copo através de um pedaço de gaze.
- Adicione 150 ml de sumo de tomate e 20 g de ágar ao filtrado no copo e adicione ddH2O até 1.000 ml.
- Preparação de materiais experimentais
- Mergulhe cerca de 50 sementes de arroz (Oryza sativa) cultivar Lijiangxintuan-heigu (LTH) em ddH2O por 3 dias ou mergulhe cerca de 50 sementes de cevada (Hordeum vulgare cv Golden Promise) em ddH2O por cerca de 1 dia.
- Embrulhar as sementes de arroz ou de cevada em gaze húmida e germiná-las em papel de filtro húmido em cerca de 30 placas de Petri com um diâmetro de 10 cm x 10 cm a 28 °C. O tempo de germinação das sementes de arroz é de cerca de 2 a 3 dias, e o tempo de germinação das sementes de cevada é de cerca de 2 dias. A umidade relativa na estufa é de aproximadamente 70%.
- Plante as mudas de arroz ou cevada em vasos usando solo para vasos autoclavado e regando e, em seguida, cubra-as com uma camada de vermiculita.
- Coloque as plantas em uma estufa ou armário de crescimento adequado a 25 ° C por cerca de 1 ~ 2 semanas.
- Corte 3 camadas de papel de filtro em círculos com uma tesoura cirúrgica estéril (cada círculo deve ter um diâmetro de 8 cm) e coloque-as em placas plásticas estéreis de 100 mm.
- Adicione ddH2O a cada prato para embeber o papel de filtro.
- Certifique-se de que o papel de filtro esteja completamente molhado, mas não adicione água extra.
- Remova o excesso de água com uma bomba de vácuo.
- Coloque 2 palitos estéreis na placa de cultura para apoiar as folhas de arroz/cevada; espaçe os palitos ~2 - 3 cm de distância.
- Colete as folhas do arroz 2 semanas após a semeadura ou retire as folhas da cevada 7 dias após a semeadura.
- Usando mudas de arroz / cevada de 4 a 6 folhas, corte a parte inferior do caule a ~ 5 cm do topo e colete as folhas.
- Protocolo de inoculação por pulverização
- Cultivar a estirpe fúngica em placas OTA numa incubadora termostática (25 °C) durante ~4 d.
- Adicione ~ 2 mL de ddH2O usando uma pipeta de 0,5 a 5 mL em cada placa de 4 dias.
- Com uma alça de inoculação, raspe os micélios da cepa selvagem de M. grisea e a cepa mutante em detritos de micélios.
- Colete os detritos de micélio e transfira-os para uma nova placa OTA. Pegue os detritos de micélio e seque na bancada limpa.
- Cubra a placa com 3 camadas de gaze para garantir a umidade necessária para o crescimento dos conídios em uma estufa a 25 ° C durante o dia (14 h) e 23 ° C à noite (10 h) por 24 - 48 h.
- Adicione 2 mL de ddH2O a cada prato e raspe os conídios suavemente com cotonetes estéreis, seguidos de uma filtragem através de 2 camadas de papel para lentes. Tenha cuidado para não arranhar a superfície do meio de cultura.
- Transfira a suspensão de conídios para um novo tubo de 50 mL com uma pipeta de 100 a 1.000 μL.
- Centrifugue por 5 min a um mínimo de 5.000 x g a 25 °C.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet para dar 2 x 104 conídios por mL em uma solução Tween-20 a 0,025% (v / v). A solução Tween-20 é geralmente de cerca de 10 a 20 mL.
- Despeje a suspensão de esporos em um pulverizador portátil.
- Castre cerca de 10 mL da suspensão de conídios nas folhas de arroz de mudas de arroz de 2 semanas ou folhas de cevada de mudas de cevada de 7 dias e incube-as a 25 ° C em uma câmara escura e úmida por ~ 24 h. Pulverize as plantas de controle com a solução Tween-20 a 0,025% (v / v).
- Transferir as folhas para outra câmara húmida sob luz fluorescente a 25 °C durante um fotoperíodo de 12 h.
- Registre os sintomas da doença 5 dias após a inoculação. Examine as lâminas de arroz / cevada doentes de ~ 6 cm de comprimento. O padrão de avaliação está de acordo com o sistema de pontuação para resistência à brusone do International Rice Research Institute (IRRI). Os detalhes do sistema de pontuação para resistência à explosão são mostrados na Tabela 1.
- Fotografe as folhas para avaliar a infecção das cepas testadas. A infecção foi avaliada pelo número de lesões por 3,6 cm2.
Tabela 1: Um sistema de pontuação para resistência à explosão. A tabela é citada do Instituto Internacional de Pesquisa do Arroz (IRRI).
| escala | descrição |
| 1 | Pequenas manchas marrons de tamanho pontual |
| algarismo | Pequenas manchas cinzentas necróticas arredondadas a ligeiramente alongadas, com cerca de 1-2 mm de diâmetro, com uma margem marrom distinta. As lesões são encontradas principalmente nas folhas superiores |
| 3 | O tipo de lesão é o mesmo que em 2, mas um número significativo de lesões está nas folhas superiores |
| 4 | Lesões blásticas suscetíveis típicas, de 3 mm ou mais, infectando menos de 4% da área foliar |
| 5 | Lesões blásticas suscetíveis típicas, de 3 mm ou mais, infectando menos de 4-10% da área foliar |
| 6 | Lesões blásticas suscetíveis típicas, de 3 mm ou mais, infectando menos de 11-25% da área foliar |
| 7 | Lesões blásticas suscetíveis típicas, de 3 mm ou mais, infectando menos de 26-50% da área foliar |
| 8 | Lesões blásticas suscetíveis típicas, 3 mm ou mais, infectando menos de 51-75% da área foliar, muitas folhas mortas |
| 9 | Lesões blásticas suscetíveis típicas, com 3 mm ou mais, infectam mais de 75% da área foliar |
