1. Cultura fúngica para M.grisea
- Prepare o meio de cultura de ágar tomate aveia (OTA) para cepas de fungos.
- Pesar 30 - 50 g de aveia, adicionar a 800 mL de água destilada/deionizada (ddH2O) e ferver a mistura durante 30 min na panela elétrica.
- Filtre o suco de aveia fervido no copo através de um pedaço de gaze.
- Adicione 150 ml de sumo de tomate e 20 g de ágar ao filtrado no copo e adicione ddH2O até 1.000 ml.
2. Preparação de materiais experimentais
- Mergulhe cerca de 50 sementes de arroz (Oryza sativa) cultivar Lijiangxintuan-heigu (LTH) em ddH2O por 3 dias ou mergulhe cerca de 50 sementes de cevada (Hordeum vulgare cv Golden Promise) em ddH2O por cerca de 1 dia.
- Embrulhar as sementes de arroz ou de cevada em gaze húmida e germiná-las em papel de filtro húmido em cerca de 30 placas de Petri com um diâmetro de 10 cm x 10 cm a 28 °C. O tempo de germinação das sementes de arroz é de cerca de 2 a 3 dias, e o tempo de germinação das sementes de cevada é de cerca de 2 dias. A umidade relativa na estufa é de aproximadamente 70%.
- Plante as mudas de arroz ou cevada em vasos usando solo para vasos autoclavado e regando e, em seguida, cubra-as com uma camada de vermiculita.
- Coloque as plantas em uma estufa ou armário de crescimento adequado a 25 ° C por cerca de 1 ~ 2 semanas.
- Corte 3 camadas de papel de filtro em círculos com uma tesoura cirúrgica estéril (cada círculo deve ter um diâmetro de 8 cm) e coloque-as em placas plásticas estéreis de 100 mm.
- Adicione ddH2O a cada prato para embeber o papel de filtro.
- Certifique-se de que o papel de filtro esteja completamente molhado, mas não adicione água extra.
- Remova o excesso de água com uma bomba de vácuo.
- Coloque 2 palitos estéreis na placa de cultura para apoiar as folhas de arroz/cevada; espaçe os palitos ~2 - 3 cm de distância.
- Colete as folhas do arroz 2 semanas após a semeadura ou retire as folhas da cevada 7 dias após a semeadura.
- Usando mudas de arroz / cevada de 4 a 6 folhas, corte a parte inferior do caule a ~ 5 cm do topo e colete as folhas.
3. Inoculação de ferimentos com cubos de micélio ou gotículas de suspensão de conídios de M. grisea
- Usando uma agulha anatômica, raspe três feridas de 2 a 3 cm de comprimento nas nervuras principais das folhas destacadas de arroz / cevada; tome cuidado para não penetrar nas folhas.
- Coloque as folhas raspadas em palitos de dente e borrife uma solução Tween-20 a 0,02% (v/v) nas folhas para formar uma camada de gotículas.
- Corte um tampão micelial de 0,5 cm x 0,5 cm para cada cepa de M. grisea (tipo selvagem, mutante, cepas de complemento ou outras cepas de teste) de uma placa OTA.
- Coloque os tampões miceliais ou gotículas de 25 μL de suspensão de conídios nas folhas feridas e incube as folhas a 25 ° C em uma câmara úmida por 3 - 8 d.
- Examine as lesões 5 - 7 dias após a inoculação. O método de exame é o mesmo que para o método de inoculação por pulverização (ver etapa 1.3.13).
- Examine as lâminas de arroz / cevada doentes de ~ 6 cm de comprimento e fotografe-as para avaliar a infecção das cepas testadas. A infecção foi avaliada pelo número de lesões por 3,6 cm2.
