1. Produção de HBV recombinante que codifica a proteína repórter
- Preparação de células HepG2
- Prepare o meio de cultura de células (meio de Eagle modificado de Dulbecco ou DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina e 100 U/ml de aminoácidos não essenciais).
- Placa 4 x 106 células HepG2 em uma placa revestida de colágeno de 10 cm em 10 ml de meio de cultura no dia anterior à transfecção. Incubar células HepG2 a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO2 a 5%
nota: Quando aproximadamente 4 x 106 células HepG2 são plaqueadas em um prato revestido de colágeno de 10 cm em 10 ml de meio de cultura, elas serão 70-90% confluentes no dia seguinte.
- Transfecção
- Transfectar células HepG2 com 5 μg de pUC1.2HBV (vírus da hepatite B) delta epsilon e 5 μg de pUC1.2HBV/NL15 usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante.
- No dia seguinte, retire o meio de cultura e adicione 10 ml de meio de cultura fresco.
- Uma semana após a transfecção, transferir o meio de cultura que contém o VHB recombinante para um tubo de 50 ml e avançar para o passo 1.3.1. Adicionar 10 ml de meio de cultura fresco à placa que contém as células transfectadas.
nota: A produção do HBV recombinante é mantida por 4 semanas. O meio de cultura contendo HBV recombinante pode ser armazenado a 4 °C por 1 mês.
- Purificação do VHB recombinante
- Remover os restos celulares do meio de cultura contendo HBV recombinante por centrifugação (2.300 x g por 5 min).
- Passe o sobrenadante por um filtro de membrana de 0,45 μm.
- Adicionar um volume igual de 26% de PEG / 1,5 M de NaCl (polietilenoglicol 6000: 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml de EDTA 0,5 M (ácido etilenodiaminotetracético) pH 8,0 e 5 ml de HEPES 1 M (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico) (pH 7,6 em 500 ml) ao meio de cultura contendo HBV recombinante e misturar suavemente. Incubar durante a noite a 4 °C.
- Centrifugue a 2.300 x g por 20 min a 4 °C.
- Rejeitar o sobrenadante e dissolver o sedimento em 0,5 ml de TNE (Tris (tris(hidroximetil)aminometano 10 mM), NaCl 50 mM, EDTA 1 mM).
- Remova os detritos por centrifugação a 2.300 x g por 5 min.
- Coloque 0,5 ml de TNE contendo HBV recombinante em 0,8 ml de sacarose a 20% em TNE.
- Centrifugar a 100.000 × g durante 3 horas a 15 °C.
- Descarte o máximo possível do sobrenadante e guarde o pellet. Ressuspendê-lo em 1 ml de DMEM isento de soro por 40 ml de meio de cultura inicial.
- Incubar durante a noite a 4 °C.
- Filtrar através de um filtro de 0,45 μm. Preparar alíquotas de 0,5 ml e conservar a -80 °C.
nota: Se for observada contaminação por proteína repórter da amostra original do vírus, purifique o vírus por ultracentrifugação com gradiente de densidade de 5-30% de sacarose em TNE a 100.000 x g por 2 horas, ou centrifugação equilibrada com densidade de CsCl de 1,1-1,6 g / ml a 150.000 x g por 50 horas.
2. Infecção do HBV recombinante
- Cultive células HepG2 expressando de forma estável NTCP (polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio) (HepG2/NTCP) que são suscetíveis à infecção por HBV em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 250 μg/ml de G-418 (geneticina) e 100 U/ml de aminoácidos não essenciais a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO5 2.
- Um dia antes da infecção, coloque aproximadamente 5 x 104 células HepG2 / NTCP em uma placa revestida de colágeno de 96 poços em 0,1 ml de meio de cultura.
- Descongele o HBV recombinante em banho-maria a 37 °C até que haja um pequeno pedaço de gelo restante no frasco.
- Prepare o meio para infecção combinando o seguinte: 10 μl de PEG8000 a 40% em solução salina tamponada com fosfato (PBS), 2 μl de dimetilsulfóxido (DMSO), 10 μl de HBV recombinante e 78 μl de meio de cultura fresco por poço de uma placa de 96 poços.
- Adicione 100 μl de solução recombinante de HBV a um poço da placa de 96 poços.
- Um dia após a infecção, lave as células infectadas 3 vezes com 300 μl de PBS por poço para remover a proteína repórter contaminante da fração do vírus.
- Incubar as células infectadas em 200 μl de meio de cultura contendo 2% de DMSO por uma semana ou menos.
3. Análise
- Uma semana após a infecção, lave as células infectadas 3 vezes com PBS.
- Adicione 50 μl de tampão de lise às células infectadas.
- Agite a placa de cultura por 5 min e, em seguida, centrifugue a 2.000 x g por 5 min.
- Adicione 50 μl do substrato repórter na placa do luminômetro.
- Adicione 20 μl de lisado celular a uma placa luminométrica contendo o substrato repórter. Misture por vórtice brevemente.
- Coloque a placa no luminômetro e inicie a leitura.
