Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE
1. Soluções necessárias
- Prepare 150 mg/L (para anestesia) ou 300 mg/L (para eutanásia) de solução de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato (MS-222) com água do aquário onde os peixes-zebra são mantidos. Encha um pequeno tanque com 1 L de solução anestésica e mantenha-o arejado.
- Encha outro pequeno tanque com 1 L de água do aquário sem MS-222 para recuperação de peixes e mantenha-o arejado.
- Faça 50 mL de 1x PBS a partir de uma solução estoque estéril 10x.
- Para análise de citometria / isolamento de células intestinais, prepare solução fresca suficiente de colagenase tipo IV a 0,15% para 1 mL por peixe a partir de uma solução estoque ou de pó no meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com penicilina a 1% v / v e estreptomicina (ver materiais). Faça alíquotas (1 por peixe) de 1 mL em tubos de centrífuga de 2 mL. Conservar a 4 °C até 30 minutos antes da etapa de dissecação.
- Para microscopia confocal/fixação de amostras, prepare 50 mL de solução fresca de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS ou descongele uma solução estoque de um freezer a -20 °C em uma capela de exaustão.
cuidado: O PFA é tóxico. Por favor, leia a ficha de dados de segurança do material antes de trabalhar com ela. Luvas e óculos de segurança devem ser usados e sempre deixar as soluções dentro de uma hotte.
2. Preparando o equipamento para intubação oral
- Coloque aproximadamente 1 cm de um tubo de silicone fino em uma agulha Luer lock 31 G para cobrir a ponta da agulha.
- Corte uma ponta de pipeta de filtro estéril de 10 μL (cerca de 2 cm), pegue a extremidade mais fina e coloque-a sobre o tubo de silicone como uma bainha. Certifique-se de que a pipeta se estenda além da ponta da agulha para evitar ferir o animal.
- Conecte a agulha a uma seringa Luer lock de 100 μL.
nota: Sempre enxágue com etanol e, em seguida, solução salina tamponada com fosfato (PBS, consulte Materiais) completamente entre os tratamentos.
3. Preparando a suspensão de nanopartículas fluorescentes
- Rotule a nanopartícula de proteína com éster Atto-488 NHS (consulte a Tabela de Materiais) ou um corante fluorescente apropriado de acordo com as instruções do fabricante.
- Ressuspenda as nanopartículas em tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M na concentração de 2 mg/mL.
- Dissolver o éster Atto 488 NHS em dimetilsulfóxido (DMSO) isento de aminas a 2 mg/ml. Mantenha uma alíquota de 10 μL para verificar a eficiência da rotulagem.
- Misture as nanopartículas e o éster Atto 488 NHS na proporção molar de 1:2 (proteína: corante) mexendo no escuro.
- Gire as nanopartículas marcadas por centrifugação a 8.000 x g por 10 min à temperatura ambiente, remova o sobrenadante e guarde-o para verificar a eficiência da rotulagem.
- Lave as nanopartículas marcadas ressuspendendo-as em 1 mL de tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M por vórtice e pipetagem para cima e para baixo. Em seguida, descarte o sobrenadante por centrifugação a 8.000 x g por 10 min à temperatura ambiente. Repita a etapa 3.6 por 5 vezes.
- Ressuspenda o pellet em 5 mL de tampão de bicarbonato de sódio 0,1 M em um tubo de centrífuga de 15 mL e faça alíquotas da nanopartícula fluorescente em tubos de centrífuga de 1,5 mL (30 alíquotas). Gire a 8.000 x g por 10 min em temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e armazene a -80 ° C protegido da luz.
4. Anestesia com peixe-zebra e intubação oral
- Jejue o peixe (>0,5 g) pelo menos 48 horas antes do experimento para esvaziar o intestino.
- Mova os peixes (12 peixes) para os tanques experimentais (6 L) uma noite antes do experimento para permitir a aclimatação12.
- Vortex bem a solução de nanopartículas (por exemplo, 2.500 rpm e 30 s) e extraia o volume desejado de suspensão de nanopartículas (por exemplo, 20–50 μL) na seringa conectada à agulha protegida.
- Coloque os peixes na solução aerada de MS-222 a 150 mg/L (ver secção 1) até que se afundem no fundo do tanque e não respondam a um beliscão da barbatana caudal; este processo demora menos de 5 min.
- Transfira rapidamente o peixe anestesiado com uma rede para uma bandeja plástica úmida, oriente o animal horizontalmente para ficar de frente para a agulha e inicie imediatamente a intubação oral.
- Apoie cuidadosamente o peixe com uma mão e abra a boca com a outra mão usando a agulha protegida. Insira suavemente a agulha no esôfago a cerca de 1 cm da abertura da boca.
nota: O operador pode sentir uma ligeira resistência quando a extremidade da ponta da pipeta passa pela guelra. Tome cuidado para não inclinar muito a entrada da agulha, o que pode perfurar a guelra.
- Injete lentamente a suspensão de nanopartículas no peixe. Certifique-se de que a suspensão não flua para fora pelas brânquias ou boca.
- Remova cuidadosamente a agulha e coloque o peixe no tanque de recuperação (consulte a seção 1). A recuperação geralmente leva 1 minuto.
- Verifique cuidadosamente se há anormalidades nos peixes (por exemplo, sangramento nas brânquias é um sinal de perfuração).
- Assim que os peixes se recuperarem, devolva-os aos tanques experimentais.
