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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Anestesiar, intubar e inocular animais
NOTA: Recomenda-se o uso de ratos Sprague-Dawley machos imunocompetentes livres de patógenos específicos (FPS) pesando 100 - 120 g. Forneça comida e água a todos os animais ad libitum e aloje-os socialmente em lascas de madeira ou outra cama absorvente com ciclos claro-escuro padrão de 12 horas.
- Antes de realizar qualquer experimento, obtenha e esterilize uma cânula de metal e tubos de polietileno de tamanho apropriado para a espécie animal. Obtenha seringas descartáveis estéreis de 1 mL e agulhas descartáveis estéreis de calibre 25.
cuidado: Sempre descarte essas seringas e agulhas em um recipiente para objetos cortantes.
- Para ratos, compre ou fabrique uma cânula de metal com aproximadamente 12 cm de comprimento, diâmetro interno de 0,9 a 1,0 mm e diâmetro externo de 1,0 a 1,2 mm e dobrada em um ângulo aproximado de 45° em uma extremidade. Corte um comprimento de 11 a 12 polegadas de tubo de polietileno com um diâmetro interno de 0,4 mm e diâmetro externo de 0,8 mm. (Consulte a Figura 1A.)
- Coloque a cânula de metal em um tubo de vidro, tampa de rosca e autoclave por métodos padrão para esterilizar. Mergulhe e guarde os pedaços cortados do tubo de polietileno em um béquer coberto contendo álcool.
- Prepare a superfície de trabalho e o dispositivo de intubação.
- Coloque um tapete descartável limpo na superfície de trabalho, próximo ao banho-maria. Transfira a cânula de metal, em seu tubo de armazenamento de vidro, para esta superfície. Remova a tampa do tubo de armazenamento e deslize a extremidade da "alça" da cânula para a extremidade aberta do tubo.
- Usando uma pinça estéril, remova um pedaço de tubo de polietileno do béquer e insira-o no interior da cânula de metal estéril, certificando-se de que ele se mova livremente. Encaixe uma agulha descartável estéril de calibre 25 (para ratos) na extremidade livre do tubo de polietileno deslizando a agulha vários mm para dentro do tubo. (Consulte a Figura 1A para ratos).
- Coloque marcas de guia na cânula de metal e no tubo de polietileno para indicar a profundidade de inserção no animal, seguindo o procedimento de intubação descrito abaixo em um único animal sacrificado. Abra a cavidade torácica para observação, coloque a cânula de metal corretamente e avance o tubo de polietileno adequadamente. Usando uma caneta indelével, marque a cânula de metal onde ela encontra a boca do animal e o tubo de polietileno onde encontra o topo da cânula de metal para ajudar na colocação adequada nos animais restantes.
- Dentro de uma capela (ou usando um sistema de limpeza apropriado), anestesiar até 6 animais por vez em uma câmara fechada fornecida com isoflurano ≤5% em oxigênio a 1,5 L/min até que o reflexo de vômito seja inibido (aproximadamente 1 min).
nota: Antes de realizar qualquer experiência, estabelecer a dose segura e o tempo de exposição do isoflurano nas condições específicas utilizadas (por exemplo, tamanho/tipo de câmara e tamanho/espécie/estirpe do animal) para evitar a exposição letal inadvertida.
- Encha uma seringa descartável estéril de 1 mL (para ratos) com solução salina estéril, colocando a ponta estéril na solução salina e puxando-a de volta no êmbolo. Encaixe a seringa na agulha encaixada no tubo de polietileno e lave todo o volume de solução salina através do tubo até que a seringa seja esvaziada.
- Encha a seringa com o inóculo à base de ágar do recipiente no banho-maria e lave o ágar-ágar através do tubo até que o tubo esteja preparado (por exemplo, completamente cheio com o ágar).
- Para ratos, remova a agulha de calibre 25 (encaixada no tubo de polietileno) da seringa descartável. Descarte a seringa usada em um recipiente para objetos cortantes. Encha uma nova seringa descartável estéril de 1 mL com o inóculo à base de ágar do recipiente no banho-maria, colocando a ponta estéril no inóculo e puxando o êmbolo para trás. Recoloque a agulha (encaixada no tubo de polietileno) e lave o ágar através do tubo pressionando o êmbolo apenas até que o tubo esteja completamente cheio de ágar.
- Remova um animal da câmara anestésica. Coloque o animal em decúbito dorsal no tapete descartável com a cabeça para a direita e a cauda para a esquerda, conforme mostrado na Figura 1C.
- Utilizando o dispositivo de intubação (ou seja, a cânula metálica equipada com tubos de polietileno), intubar o animal e inserir a cânula no lobo grande do pulmão esquerdo (ver figura 1D).
- Insira a extremidade livre da cânula de metal na boca do animal. Gire a cânula de modo que a extremidade livre fique inclinada para cima e avance-a suavemente para dentro da traqueia, contornando cuidadosamente as estruturas laríngeas com um leve movimento de torção. Confirme a inserção na traqueia em oposição ao esôfago deslizando suavemente a cânula ligeiramente para frente e para trás várias vezes enquanto palpa os anéis traqueais com o dedo indicador esquerdo, conforme mostrado na Figura 1C.
- Quando a cânula atingir a bifurcação onde a traqueia se divide nos brônquios esquerdo e direito, faça um leve movimento de torção em direção ao lado esquerdo do animal para garantir que a cânula seja inserida no brônquio esquerdo. Avance a cânula de metal até que a extremidade esteja a meio caminho de três quartos do pulmão esquerdo, usando a marca guia colocada anteriormente para confirmar que a profundidade apropriada foi atingida.
- Com a cânula de metal no lugar, avance o tubo de polietileno vários mm. Use a marca guia colocada anteriormente no tubo para garantir que ele avance apenas o suficiente para sair da extremidade da cânula de metal e não perfurar o pulmão.
- Com ambas as cânulas colocadas, use a seringa acoplada para instilar 100 μL (para ratos) da suspensão de ágar profundamente no lobo grande do pulmão esquerdo (ver Figura 1D). Retire vários mm do tubo de polietileno e, em seguida, remova cuidadosamente o dispositivo de intubação intacto. Coloque-o de volta no tubo de armazenamento de vidro e mova o animal para uma gaiola nova para se recuperar.
