Canulação do Ducto Linfático Mesentérico em Modelo de Rato para Colheita de Fluido Linfático

Resumo

Fonte: Trevaskis, N. L., et al. O modelo de rato canulado do ducto linfático mesentérico: aplicação à avaliação do transporte de drogas linfáticas intestinais. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra uma técnica para canular o ducto linfático mesentérico em ratos. Este método permite o acesso direto a todo o volume de componentes presentes no fluido linfático.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Canulação do Ducto Linfático Mesentérico

1. Coloque o animal com o lado direito voltado para o operador. Realize a cirurgia com ou sem a ajuda de um microscópio cirúrgico, conforme necessário.
2. Abra a camada superior da parede muscular abdominal com uma incisão reta de 4 cm estendendo-se da linha média (processo xifóide) até o flanco direito aproximadamente 2 cm abaixo da caixa torácica (margem costal) usando uma lâmina de bisturi estéril (ver Figura 1B).
3. Abra as camadas restantes da parede muscular abdominal de 4 a 5 mm lateral à linha média até o flanco direito com uma pequena tesoura cirúrgica (ver Figura 1B).
4. Retraia o intestino delgado sob a parede muscular abdominal esquerda e mantenha-o no lugar usando 2 a 3 pedaços de gaze estéril saturada com solução salina normal.
5. Faça uma ponte entre o rato e uma seringa de plástico de 10 ml colocada horizontalmente sob as costas do rato, ao nível do rim direito, para facilitar a visualização do ducto linfático mesentérico.
6. Localize o ducto linfático mesentérico superior: um vaso de aproximadamente 0,5 a 1 mm de diâmetro que é perpendicular ao rim direito e imediatamente rostral e paralelo à artéria mesentérica (um vaso sanguíneo vermelho escuro pulsátil; ver Figura 1C).
   NOTA: Em ratos sem jejum ou pré-dosados com óleo, o vaso é branco, opaco e mais fácil de visualizar do que em ratos em jejum, nos quais é bastante translúcido.
7. Inspecione a área imediatamente caudal ao grande ducto linfático mesentérico superior e à artéria mesentérica para determinar se um segundo ducto linfático acessório menor está presente. Se presente, bloqueie o fluxo de linfa através do ducto cortando o ducto e ocluindo com supercola, ou amarrando uma sutura ao redor do ducto, para garantir que todo o volume de linfa que flui do intestino seja coletado do ducto linfático mesentérico superior.
8. Passe um par de pinças retas pelo leito adiposo perirrenal na margem inferior do rim direito e pelas camadas de tecido conjuntivo imediatamente abaixo da veia cava, em uma direção paralela ao ducto linfático mesentérico superior.
9. Com a ponta da pinça, segure a cânula linfática e puxe-a através do leito adiposo perirrenal, com uma extremidade imediatamente adjacente ao ducto linfático mesentérico e a outra exteriorizada do animal ao nível do rim direito.
10. Isole o ducto linfático mesentérico das camadas sobrepostas de tecido conjuntivo e adiposo por dissecção romba. Tome cuidado para não perfurar ou danificar o ducto linfático.
11. Depois de isolar o ducto linfático, faça um pequeno orifício no ducto linfático com uma microtesoura, a ponta afiada da pinça do joalheiro ou uma agulha de 25 G. Tome cuidado para não cortar completamente o recipiente.
12. Certifique-se de que a cânula linfática esteja completamente preenchida com uma solução anticoagulante (usando uma seringa e agulha 25 G) sem espaços de ar. Insira a cânula linfática aproximadamente 2 - 4 mm dentro do ducto linfático mesentérico através do pequeno orifício com o auxílio de um pequeno par de pinças.
13. Observe a cânula linfática por alguns minutos. Observe um fluxo gradual de linfa intestinal da extremidade coletora livre da cânula se a canulação for bem-sucedida. Se a canulação não for bem-sucedida, repita as etapas 1.8 - 1.12.
14. Se a canulação for bem-sucedida, prenda a cânula colocando uma pequena gota de adesivo veterinário sobre o orifício de entrada no ducto linfático. Tome cuidado para não ocluir o vaso por meio da aplicação de adesivo veterinário em excesso.
15. Enquanto espera que o adesivo veterinário endureça, observe o fluxo de linfa por vários minutos para garantir que o procedimento de canulação foi bem-sucedido. Uma vez certo o sucesso da canulação, remova cuidadosamente os pedaços de gaze que foram colocados na cavidade abdominal e coloque o intestino delgado em sua posição original.
16. Pré-pese os tubos de coleta de linfa, rotule os tubos para coleta de amostras de linfa e sangue e adicione solução anticoagulante. Adicionar solução anticoagulante suficiente para atingir uma concentração final de 1 mg/ml de EDTA em água estéril ou de 10 a 20 UI/ml de heparina na linfa ou no sangue colhido.
17. Coloque um tubo de coleta de linfa contendo um anticoagulante (etapa 1.16) na extremidade da cânula para coletar a linfa de fluxo livre.
18. Em seguida, canule o duodeno para infusão de soluções e/ou formulações de reidratação.

Resultados

Figura 1. Fotografias de (A) o abdômen raspado em preparação para canular o ducto linfático, (B) a parede do músculo abdominal aberta com uma incisão reta de 4 cm estendendo-se da linha média até o flanco direito para acessar o ducto linfático e (C) o ducto linfático mesentérico superior (em círculo amarelo) perpendicular ao rim direito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina estéril	Baxter saúde	AHB 1307	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui são os sacos de solução salina Baxter de 100 ml, caixa de 50
70 % de etanol em água	qualquer		Qualquer marca pode ser usada
Solução de gluconato de clorexidina (Microshield 4)	Aeroporto Internacional de Livingstone	JJ60243L	Qualquer marca pode ser usada. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L
Solução Betadine	Aeroporto Internacional de Livingstone	BU0510	Qualquer marca pode ser usada. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT=6&search =BU0510
Ilium Ketamil (Cetamina 100 mg/ml)	VETERINÁRIO VITÓRIA	KETA I 1	http://www.provet.vom.au
Heparina (35000I.U. em 35 mL	SigmaFarmacêutica	Rolamento 337220	http://www.sigmaco.com.au
Cânula de polietileno (PE) o.d. 0,96 mm x i.d. 0,58 mm	Extensões de microtubos	PE8050	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tubulação PE 0,96 x0,58 mm, 30 m
Cânula de polietileno (PE) od. 0,8 mm x diâmetro interno 0,5 mm	Extensões de microtubos	PE9658	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tubulação PE 0,8 x0,5 mm, 30 m
Marcadores	qualquer		Qualquer marca pode ser usada
Adesivo veterinário	qualquer		Qualquer marca pode ser usada
Agulhas de calibre 23	Aeroporto Internacional de Livingstone	DN23GX0.75LV	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a Agulha Descartável Livingstone, Estéril, 23GX0.75inch, 100/BOX. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT= 6&search=DN23GX0.75LV
Agulhas de calibre 25	Aeroporto Internacional de Livingstone	DN25GX1.0LV	Qualquer marca pode ser usada. O exemplo aqui é a Agulha Descartável Livingstone, Estéril, 25GX1.0inch, 100/BOX. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV
Seringa de 1 ml	Aeroporto Internacional de Livingstone	T3SS01TA	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a seringa Terumo 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA
Seringa de 10 ml	Aeroporto Internacional de Livingstone	T3SS10SA	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a seringa Terumo 10 ml Slip 100/Box. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA
Cotonetes de gaze	Aeroporto Internacional de Livingstone	GSC075	Qualquer marca pode ser usada e cortada no tamanho necessário. Exemplo aqui é cotonetes de gaze de algodão preenchidos 7,5x7,5 cm, 8 camadas. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT=6&search =GSC075
Almofada de aquecimento	Ratek	WT1	Qualquer marca que mantenha a temperatura em 37C pode ser usada. Exemplo aqui é a bandeja de aquecimento Ratek.
Microscópio cirúrgico	Zeiss	Nº 495005-0014-000	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o estereomicroscópio Zeiss Stemi 2000-C com suporte S Double Spot e KL 300 LED. https:// www.micro-shop.zeiss.com/? l=en&p=us&f=e&i=10143
1 x tesoura cirúrgica pequena	Ferramentas de Belas Ciências (FST)	14060-09	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tesoura fina FST, 9 cm com aresta de corte de 21 mm, afiada, reta. http://www.finescience.ca/ páginas especiais / Products.aspx? ProductId=40&CategoryId=17
2 x fórceps com ponta curva serrilhada	Ferramentas de Belas Ciências (FST)	11001-13	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a pinça de padrão padrão FST de 13 cm com ponta curva de 2,8x1,4 mm. http://www.finescience.ca/ páginas especiais / Products.aspx? CódigoDoProduto=405&CódigoDaCategoria=32