Canulação intraduodenal em modelo de rato para estudos de imunopatologia

Resumo

Fonte: Trevaskis, N. L. et al., O Modelo de Rato Canulado do Ducto Linfático Mesentérico: Aplicação à Avaliação do Transporte Linfático Intestinal.J. Vis. Exp.(2015)

Este vídeo demonstra a canulação intraduodenal em um modelo de rato. Após anestesiar o rato, o duodeno é localizado e uma pequena punção é criada. Uma cânula em forma de J com ponta chanfrada é cuidadosamente inserida e presa, e a incisão é fechada. O modelo de rato canulado permite a infusão intra-intestinal para estudos de imunopatologia.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparações na véspera do procedimento cirúrgico

1. Jejue o rato na noite anterior à cirurgia, se necessário. Certifique-se de que o rato tenha livre acesso à água.
2. Prepare as soluções a serem administradas ao rato.
   1. Prepare uma solução de reidratação, como solução salina estéril ou solução de Ringer.
   2. Prepare soluções anestésicas conforme necessário. O anestésico utilizado nos experimentos aqui descritos consistiu em "Coquetel 1" preparado pela combinação de 1,9 ml de cetamina 100 mg/ml, 0,5 ml de xilazina 100 mg/ml, 0,2 ml de acepromazina 10 mg/ml e 2,5 ml de solução salina e "Coquetel 2" consistindo de 1 ml de cetamina 100 mg/ml e 0,1 ml de acepromazina 10 mg/ml. OBSERVAÇÃO: O isoflurano ou o sevoflurano inalatórios podem ser preferidos, pois podem fornecer um plano cirúrgico de anestesia por um longo período de tempo.
3. Prepare uma solução anticoagulante contendo 10 mg / ml de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em água estéril ou 10 UI / ml de heparina em solução salina para lavar a cânula linfática. Além disso, prepare uma solução anticoagulante contendo 2,5 - 10 UI / ml de heparina em solução salina para lavar a cânula da artéria carótida.
4. Prepare a cânula de polietileno para inserção no duodeno (0,96 mm OD, 0,58 mm DI)
   1. Corte a cânula no comprimento necessário (normalmente 25 - 30 cm para a cânula duodenal) e coloque um chanfro na ponta da cânula usando uma lâmina cirúrgica estéril (ver Figura 1).
      nota: Isso aumenta a facilidade de inserção da cânula e reduz a incidência de bloqueio da cânula após a inserção.
   2. Coloque um ponto de ancoragem em forma de J na cânula intraduodenal enrolando uma pequena porção da cânula de volta sobre si mesma, aquecendo-a com um isqueiro ou placa quente e, em seguida, cortando-a no tamanho certo (veja a Figura 1).
5. Encaixe a cânula linfática a uma agulha e seringa de 25 G contendo uma solução anticoagulante (preparada no passo 1.3). Encha a cânula linfática com a solução anticoagulante e deixe a solução na cânula durante a noite (O/N) para reduzir a incidência de formação de coágulos na cânula linfática durante a colheita linfática.
6. Prepare tubos para coleta de amostras de linfa e sangue. Pré-pese os tubos de coleta de linfa, rotule os tubos para coleta de amostras de linfa e sangue e adicione solução anticoagulante. Adicione uma solução anticoagulante suficiente para atingir uma concentração final de 1 mg/ml de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em água estéril ou 10 a 20 UI/ml de heparina na linfa ou no sangue coletado.

2. Preparações imediatamente antes do início do procedimento cirúrgico

1. Verifique as cânulas lavando-as com solução salina estéril ou anticoagulante para garantir que estejam patentes.
2. Prepare o rato para o procedimento cirúrgico.
   1. Anestesiar o rato durante todo o período de cirurgia e coleta de amostras.
      1. Por exemplo, inicie a anestesia por meio de injeção subcutânea de 1,5 ml / kg de Cocktail I (da etapa 1.2.2) em uma dobra cutânea na parte de trás do pescoço do rato usando uma seringa de 1 ml conectada a uma agulha de 25 G. Mantenha a anestesia por injeção intraperitoneal de 0,44 ml / kg de Coquetel 2 (da etapa 1.2.2) aproximadamente a cada hora, conforme necessário, usando uma seringa de 1 ml conectada a uma agulha de 25 G.
      2. Antes de iniciar a cirurgia, certifique-se de que a profundidade da anestesia seja suficiente, observando a frequência respiratória, o movimento do bigode, o tônus muscular e as respostas a estímulos como beliscar o pé. Administre anestesia adicional conforme necessário.
   2. Raspe o pelo das regiões cirúrgicas, que incluem o lado direito do abdômen, para canulação do duodeno.
   3. Limpar as regiões cirúrgicas assepticamente com solução de iodopovidona ou solução de clorexidina e esfoliante com etanol a 70%. Repita isso 3 vezes para cada região, finalizando com uma limpeza final com etanol 70%.
3. Colocar o animal em decúbito dorsal sobre um lençol limpo, por cima de uma almofada cirúrgica aquecida (37 °C).

3. Canulação do duodeno

1. Coloque o animal com o lado direito voltado para o operador. Realize a cirurgia com ou sem a ajuda de um microscópio cirúrgico, conforme necessário.
2. Abra a camada superior da parede muscular abdominal com uma incisão reta de 4 cm que se estende da linha média (apêndice xifóide) até o flanco direito aproximadamente 2 cm abaixo da caixa torácica (margem costal) usando uma lâmina de bisturi estéril (ver Figura 2B).
3. Abra as camadas restantes da parede muscular abdominal de 4 a 5 mm laterais à linha média até o flanco direito com uma pequena tesoura cirúrgica (ver Figura 2B).
4. Retraia o intestino delgado sob a parede muscular abdominal esquerda e mantenha-o no lugar usando 2 a 3 pedaços de gaze estéril saturada com solução salina normal.
5. Conecte a cânula do duodeno a uma seringa (por exemplo, 10 ml) cheia da solução de reidratação.
6. Identifique o duodeno como a seção rosa brilhante (com mais vasos sanguíneos) do intestino delgado, que após um puxão suave para baixo revela o estômago.
7. Faça um pequeno orifício no duodeno aproximadamente 2 cm abaixo da junção do estômago e duodeno (o piloro) usando uma agulha estéril de 23 G.
8. Insira a extremidade em forma de J da cânula duodenal através do orifício de punção. Prenda no lugar com uma gota de cola de cianoacrilato.
9. Inicie a hidratação do rato conectando a cânula à seringa de reidratação carregada em uma bomba de infusão. De acordo com a literatura, as taxas de reidratação variam de 0,5 a 3 ml/h.
10. Após a conclusão da canulação da linfa e do duodeno, feche a incisão na parede do músculo abdominal com suturas. Em seguida, feche a incisão na pele aplicando algumas gotas de adesivo tecidual (cianoacrilato) ao longo da lateral da incisão e apertando a pele em ambos os lados da incisão.

Resultados

Figura 1. Representação esquemática da forma da ponta chanfrada de uma artéria carótida ou cânula linfática e da ponta chanfrada em forma de J de uma cânula duodenal.

Figura 2. Fotografias de (A) o abdômen raspado em preparação para canular o ducto lin...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina estéril	Baxter saúde	AHB 1307	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui são os sacos de solução salina Baxter de 100 ml, caixa de 50
70 % de etanol em água	qualquer		Qualquer marca pode ser usada
Solução de gluconato de clorexidina (Microshield 4)	Aeroporto Internacional de Livingstone	JJ60243L	Qualquer marca pode ser usada. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
Solução Betadine	Aeroporto Internacional de Livingstone	BU0510	Qualquer marca pode ser usada. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
Ilium Ketamil (Cetamina 100 mg/ml)	VETERINÁRIO VITÓRIA	KETA I 1	http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml)	VETERINÁRIO VITÓRIA	TRO-3828	http://www.provet.com.au/
Injeção ACP 10 (Acepromazina 10 mg / ml)	VETERINÁRIO VITÓRIA	VTG-DACP010020	http://www.provet.com.au/
Heparina (35000I.U. em 35 mL)	Sigma Farmacêutica	Rolamento 337220	http://sigmaco.com.au/
Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) di-hidratado	Sigma-Aldrich	E1644	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o sal dissódico de EDTA da Sigma.
Cânula de polietileno (PE) o.d. 0,96 mm x i.d. 0,58 mm	Extensões de microtubos	PE8050	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tubulação PE 0,8x0,5 mm, 30 m
Cânula de polietileno (PE) o.d. 0,8 mm x i.d. 0,5 mm	Extensões de microtubos	PE9658	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tubulação PE 0,96x0,58 mm, 30 m
régua	qualquer		Qualquer marca pode ser usada
Marcadores	qualquer		Qualquer marca pode ser usada
isqueiro	qualquer		Qualquer marca pode ser usada
Cola de cianoacrilato	qualquer		Qualquer marca pode ser usada
Agulhas de calibre 23	Aeroporto Internacional de Livingstone	DN23GX0.75LV	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a Agulha Descartável Livingstone, Estéril, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DN23GX0.75LV
Agulhas de calibre 25	Aeroporto Internacional de Livingstone	DN25GX1.0LV	Qualquer marca pode ser usada. O exemplo aqui é a Agulha Descartável Livingstone, Estéril, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DN25GX1.0LV
Seringa de 1 ml	Aeroporto Internacional de Livingstone	T3SS01TA	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a seringa Terumo 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA
Seringa de 10 ml	Aeroporto Internacional de Livingstone	T3SS10SA	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a seringa Terumo 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA
Cotonetes de gaze	Aeroporto Internacional de Livingstone	GSC075	Qualquer marca pode ser usada e cortada no tamanho necessário. Exemplo aqui é cotonetes de gaze de algodão preenchidos 7,5x7,5 cm, 8 camadas. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075
Almofada de aquecimento	Ratek	WT1	Qualquer marca que mantenha a temperatura em 37C pode ser usada. Exemplo aqui é a bandeja de aquecimento Ratek.
Luz cirúrgica	Aparelho de Harvard	72-0215 com 72-0267	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o aparelho Harvard V-Lux 1000 Cold Light Source com guia de luz bifurcada Gooseneck, preto, 4,7 mm de diâmetro de fibra (cada braço). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
Microscópio cirúrgico	Zeiss	Nº 495005-0014-000	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o estereomicroscópio Zeiss Stemi 2000-C com suporte S Double Spot e KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Sutura de seda	Aeroporto Internacional de Livingstone	DTSK163019F4	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é * Envie este item para meu amigo 3/8 Círculo Corte Reverso Sutura de Seda 3/0 Fio 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4
Lâminas de bisturi	Ferramentas de Belas Ciências (FST)	10020-00	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a lâmina de bisturi FST # 20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Cabo de bisturi	Ferramentas de Belas Ciências (FST)	10004-13	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o cabo de bisturi FST #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x tesoura cirúrgica pequena	Ferramentas de Belas Ciências (FST)	14060-09	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a tesoura fina FST, 9 cm com aresta de corte de 21 mm, afiada, reta. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x fórceps com ponta curva serrilhada	Ferramentas de Belas Ciências (FST)	11001-13	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é a pinça de padrão padrão FST de 13 cm com ponta curva de 2,8x1,4 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
2 x Hemostáticos	Ferramentas de Belas Ciências (FST)	13010-12	Qualquer marca pode ser usada. Nem todos os operadores usam os hemostáticos. Exemplo aqui são os hemostáticos Micro-Mosquito FST de 12 cm com 20 mm de comprimento x 1,3 mm de largura serrilhada, ponta reta. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x suporte de agulha de sutura	Ferramentas de Belas Ciências (FST)	12001-13	Qualquer marca pode ser usada. Exemplo aqui é o porta-agulhas FST 13cm Hasley com ponta de 16 mm de comprimento x 1,9 mm de largura. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70