Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação do extrato da glândula lacrimal
NOTA: Os ratos foram anestesiados com a injeção intraperitoneal de cetamina (75 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). A anestesia adequada foi confirmada por pinçamento do dedo do pé e pinçamento da cauda. Gel oftálmico foi aplicado nos olhos do rato para evitar o ressecamento após cada procedimento. Os ratos anestesiados foram colocados sob luzes infravermelhas distantes para manter os animais aquecidos até que se recuperassem totalmente. Durante os procedimentos e o tempo de recuperação, os animais foram monitorados de perto pelos pesquisadores. Todos os materiais e ferramentas cirúrgicas foram estéreis antes do uso. Ao final do experimento, os ratos foram eutanasiados pela injeção intraperitoneal de pentobarbital (80 mg/kg). A eutanásia completa foi verificada pela falta de pulso cardíaco e sem reflexo de piscar ao tocar o globo ocular. Os ratos foram alojados em condições padrão: temperatura ambiente, 21-23 °C; umidade relativa, 30-70%; ciclo claro-escuro, alternando 12 h (7h às 19h).
- Coloque as ratas Sprague-Dawley sacrificadas (faixa etária de 8 semanas a 16 semanas) na horizontal, com uma orelha contra a mesa e a outra voltada para cima. Faça uma incisão de 10 mm superior-inferiormente sob a orelha exposta com uma tesoura de mola. Remova a glândula lacrimal dissecando-a do tecido conjuntivo circundante e do ducto de drenagem.
- Conservar as glândulas a -80 °C até serem necessárias. Descongele as glândulas no gelo. Pique o mais finamente possível no gelo com uma tesoura. Adicione 150 μL de solução salina tamponada com fosfato ou PBS com 1x inibidor de protease por glândula lacrimal.
- Sonicar as amostras no gelo por 5 min a 20 kHz com o sonicador ajustado em 10 s ligado e 10 s desligado em 30% de amplitude. Centrifugue as amostras sonicadas por 20 min a 13.000 x g e 4 °C.
- Pipetar o sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo. Alicote o sobrenadante a tubos de 1,5 mL e armazene-os a -80 °C. Meça a concentração de proteína com um ensaio de ácido bicinconínico, de acordo com as instruções do fabricante.
2. Preparação de emulsão e toxina da coqueluche
- emulsão
- Adicione 40 mg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra morto pelo calor em 10 mL de adjuvante de Freund completo contendo 1 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis H37Ra e misture bem.
nota: O adjuvante final completo de Freund contém 5 mg / mL de Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- Pese a ovalbumina, dissolva-a em PBS e prepare uma mistura de antígenos contendo 2 mg / mL de ovalbumina e 10 mg / mL de extrato de glândula lacrimal. Com o objetivo de um volume de injeção de 200 μL para cada animal, prepare uma mistura principal com base no número de animais.
- Transfira o adjuvante de Freund incompleto ou o adjuvante de Freund completo para um tubo de 50 mL, garantindo que o volume do adjuvante à mistura de antígenos esteja na proporção de 1:1. Adicione a mistura de antígenos gota a gota ao adjuvante durante o vórtice com a velocidade mais alta para que não resulte em derramamento. Continue o vórtice por 5 minutos depois que todo o antígeno tiver sido adicionado.
- Transfira a emulsão para uma seringa de 5 ml e ligue-a a outra seringa de 5 ml através de um conector de seringa. Empurre a emulsão de uma seringa para a outra para misturá-la.
nota: A emulsão está pronta se uma única gota permanecer como uma esfera quando colocada na água. Só deve ser utilizada emulsão recém-preparada ou armazenada durante a noite a 4 °C.
- Toxina da coqueluche
- Reconstitua 50 μg de toxina coqueluche em 500 μL de água para fazer uma concentração final de 100 ng/μL. Votex o recipiente por 30 segundos para certificar-se de que a toxina se dissolve completamente.
nota: Não esterilize por filtração, pois isso resultará em perda de material. Não congele. Esta solução permanece ativa por pelo menos 6 meses a 4 °C.
- Dilua 100 ng/μL de toxina da coqueluche para 3 ng/μL usando PBS. Transferir 100 μL da toxina da tosse convulsa diluída para uma seringa de injeção Luer-lock de 1 ml com uma agulha de 27 G.
3. Imunização dos ratos de Lewis
- No dia 0, misture a emulsão algumas vezes. Distribua 200 μL da emulsão, que contém 1 mg de extrato de glândula lacrimal e 200 μg de ovalbumina em adjuvante completo de Freund, em seringas Luer-lock de 1 mL com agulhas 27G. Injete a emulsão por via subcutânea na base das caudas de rato sem anestesia.
nota: A cauda não precisa ser pré-aquecida antes da injeção. Cada rato é imunizado com 1 mg de extrato de glândula lacrimal e 200 μg de ovalbumina em adjuvante completo de Freund com 500 μg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- No dia 14, injetar 200 μL da emulsão, que contém 1 mg de extrato de glândula lacrimal e 200 μg de ovalbumina no adjuvante de Freund incompleto, da mesma forma que no dia 0. Injetar 300 ng de toxina da tosse convulsa em 100 μL de PBS por via intraperitoneal por rato no mesmo dia.
4. Injeção da mistura de antígenos na subconjuntiva forniceal e na glândula lacrimal para recrutar células imunes específicas do antígeno e causar inflamação local
- Calcular a quantidade de ovalbumina e de extracto de glândula lacrimal com base no número de ratos na experiência. Pese a quantidade necessária de ovalbumina e combine-a com o extrato de glândula lacrimal descongelado preparado na etapa 1, fazendo uma solução de antígeno contendo 1 mg / mL de ovalbumina e 1 mg / mL de extrato de glândula lacrimal.
- Anestesiar os ratos com cetamina (75 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal. Aperte os dedos dos pés dos ratos para garantir que a anestesia adequada tenha sido alcançada (ou seja, nenhum movimento responsivo é observado após o beliscão). Injete 5 μL de antígeno na subconjuntiva forniceal do olho. Injete 20 μL de antígeno na glândula lacrimal.
5. Avaliação das características do olho seco
NOTA: Os ratos anestesiados devem ser segurados suavemente por uma mão enluvada na posição vertical em uma superfície plana para evitar movimentos.
- Meça o volume de lágrima com fio vermelho de fenol.
- Use um par de pinças para segurar o fio e outro para puxar a pálpebra inferior do rato. Coloque a linha no canto proximal do fórnice inferior por 1 minuto e, em seguida, remova a linha.
nota: As lágrimas tornam a parte molhada do fio vermelha.
- Tire uma imagem do comprimento da parte molhada do fio ao lado de uma régua com marcações milimétricas. Meça o comprimento molhado até o décimo de milímetro usando um software de imagem (por exemplo, ImageJ).
- Meça a suavidade da córnea/lágrima.
- Coloque o rato sob um estereomicroscópio equipado com um iluminador de anel e uma câmera. Aplique 5 μL de solução salina na córnea do rato. Pisque passivamente movendo as pálpebras superior e inferior com os dedos enluvados ~ 5 vezes para espalhar a solução salina.
- Foque o iluminador de anel no meio da superfície da córnea com ampliação de 1,6x. Adquira imagens fotográficas após 10 s.
nota: O iluminador de anel projeta duas fileiras circulares de imagens de pontos nas córneas do animal. O espaçamento regular dos pontos não distorcidos sugere uma camada lisa de córnea/lágrima.
