Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Semeadura de células peritoneais em lâminas de canal
- Depois de pipetar a suspensão peritoneal de células de macrófagos de camundongo para cima e para baixo para reduzir a aglomeração, pipete a suspensão de 100 μL no canal pré-preenchido (volume de 100 μL) de uma lâmina de canal revestida com fibronectina (um canal de 100 μL tem as dimensões (comprimento x largura x altura): 50 mm x 5 mm 0,4 mm).
- Pré-encha a câmara adicionando 1 mL de meio RPMI 1640 (Hepes) suplementado com soro a um dos dois reservatórios da lâmina do canal, inclinando a lâmina e, em seguida, aspirando o meio do reservatório a jusante (Figura 1).
- Remova bolhas de ar indesejadas ou longas tiras de ar no canal adicionando 1–2 mL de meio a um dos dois reservatórios, aplicando firmemente uma tampa do reservatório e, em seguida, bombeando o ar por meio de pressão rítmica do polegar na tampa e, quando necessário, inclinando a lâmina. Depois de expelir o ar, incline a corrediça com o reservatório sem tampa (e contendo meio) para baixo antes de remover a tampa para evitar que o ar seja sugado de volta para o canal.
- Incubar a lâmina do canal, semeada com células, em uma câmara úmida por 2 h a 37 ° C na ausência de CO2 (CO2 não é necessário, pois o sistema tampão HCO3-/CO2 é substituído por Hepes). As corrediças do canal podem ser convenientemente colocadas em um rack, que comporta oito corrediças. Normalmente, 6 a 8 lâminas são preparadas a partir de um mouse, embora até 10 ou mais sejam possíveis.
- Remova o rack e troque o meio RPMI 1640 (Hepes) em cada lâmina pelo meio RPMI 1640 contendo bicarbonato, suplementado com 10% de soro fetal bovino, bem como penicilina/estreptomicina.
- Inclinar a lâmina e aspirar o meio primeiro do reservatório inferior e depois do reservatório superior. Em seguida, adicione 1 mL do novo meio a um dos reservatórios, incline a lâmina e aspire o meio do reservatório a jusante, depois de ter fluído pelo canal.
- Após esta etapa de lavagem (troca do meio), encha a lâmina do canal adicionando 1 mL de meio a um dos reservatórios.
nota: As etapas de lavagem usando lâminas de canal são muito simples e eficazes em termos de troca de solução e remoção de células não aderentes. Observe que o meio RPMI 1640 (bicarbonato) é normalmente pré-incubado com 5% de CO2 durante a noite para garantir o equilíbrio térmico e de pH.
- Incubar as células durante a noite a 37 °C numa incubadora humidificada com 5% de CO2. Realize experimentos no dia seguinte.
2. Isolamento de glóbulos vermelhos humanos
- No dia 2 (o segundo dia de experimentos; após a incubação noturna dos macrófagos peritoneais isolados), colete 1–2 mL de sangue venoso periférico de um doador saudável, em um tubo heparinizado. Transfira 1 mL para um tubo de microcentrífuga de fundo redondo de 2,0 mL (polipropileno), centrifugue a 300 x g por 5 min a 18 ° C (configuração empírica) e remova o sobrenadante (plasma e buffy coat).
- Aspire suavemente 100 μL dos glóbulos vermelhos sedimentados e misture este volume 1:1 com o meio RPMI 1640 (Hepes) modificado (descrito abaixo) em um tubo de microcentrífuga de fundo redondo de 2,0 mL. Rotule o tubo "1:1".
nota: O meio RPMI 1640 (Hepes) usado no dia 2 (para ensaios) após o isolamento das células contém, além de 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor, penicilina (100 unidades/mL), estreptomicina (100 μg/mL) e 1 mM de N-(2-mercaptopropionil)glicina (para reduzir a fototoxicidade). Doravante, este meio é referido como meio RPMI 1640 (Hepes) "modificado".
- Pipete 4 μL da suspensão diluída de glóbulos vermelhos 1:1 em meio RPMI 1640 modificado de 2 mL (Hepes), pré-pipetado em um tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (repita esta etapa, ou seja, prepare 2 tubos). Rotule cada tubo como "4:2000". Coloque os tubos "1:1" e "4:2000" no gelo.
3. Marcação da membrana plasmática dos macrófagos
- Remova as lâminas de canal semeadas da incubadora de CO2 e troque o meio RPMI 1640 (bicarbonato) em cada lâmina por um meio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Em seguida, coloque as células em uma câmara úmida a 37 ° C na ausência de CO2.
nota: Após incubação e lavagem durante a noite, a maioria dos linfócitos é removida do canal. A maioria das células aderentes restantes são macrófagos, que podem ser identificados morfologicamente ou por coloração por imunofluorescência usando anticorpo anti-F4/80. Cerca de 95% dos macrófagos peritoneais residentes em camundongos são positivos para F4/80.
- Anticorpo anti-camundongo F4/80 diluído marcado com verde fluorescente (armazenado a 4 °C) 1:40 em meio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Pegue uma lâmina, incline-a e pipete (gota a gota) 100 μL da mistura de anticorpos na abertura do canal de 100 μL da lâmina (veja a Figura 1). Meio aspirado que flui para o reservatório a jusante. Incubar as células durante 20 min a 37 °C (ambiente humidificado, sem CO2). Durante o período de incubação, rotule os glóbulos vermelhos humanos (ver Secção 5).
nota: Como aludido acima, o CO2 não é necessário, uma vez que o sistema tampão HCO3-/CO2 é substituído pelo Hepes.
- Após 20 minutos de incubação (durante os quais os glóbulos vermelhos humanos são corados e opsonizados), lave a lâmina adicionando 1 mL de meio RPMI 1640 modificado (Hepes) a um dos reservatórios e aspirando o meio depois de ter fluído pelo canal, facilitado pela inclinação da lâmina. Adicione 1 mL de meio para armazenamento de curto prazo ou prossiga para um experimento (ou seja, pipetagem em partículas (glóbulos vermelhos opsonizados) e fagocitose por imagem por microscopia confocal de disco giratório de lapso de tempo).
4. Marcação da membrana plasmática dos glóbulos vermelhos humanos
- Comece a marcação dos glóbulos vermelhos humanos imediatamente após a incubação de uma lâmina de macrófagos com anticorpo anti-F4/80 marcado com fluorescência verde (após a Seção 3.2). Após uma mistura suave, retire 400 μL de um dos tubos "4:2000" (consulte a Seção 2.3) e distribua-os em um tubo de microcentrífuga (fundo redondo) de 2,0 mL. Dê tempo para que a suspensão aqueça até cerca de 37 °C (ver parágrafo abaixo). Adicione 0,4 μL de corante de membrana plasmática fluorescente laranja/vermelho (alíquotas armazenadas a -20 °C), misture e incube a 37 °C por 5 min.
nota: Um bloco de alumínio aquecido, colocado dentro da capela de fluxo laminar, é útil para minimizar a perda de calor durante a preparação de lâminas. Os tubos podem ser colocados em poços do bloco de aquecimento e uma placa de alumínio aquecida separada ou integrada pode servir como espaço de trabalho.
- Após o período de incubação de 5 minutos, prepare a primeira etapa de lavagem adicionando 1600 μL de meio RPMI 1640 modificado (Hepes) (para encher o tubo de microcentrífuga de 2,0 mL).
- Centrifugue o tubo a 300 x g durante 5 min a 18 °C (configuração empírica). Um pellet vermelho compacto deve ser visível na parede (ou seja, fora do centro) na parte inferior do tubo. Gire o tubo de modo que o pellet fique voltado para cima e remova cuidadosamente todo o sobrenadante sucessivamente (em duas etapas) usando uma ponta de pipeta de 1 a 1,5 mL.
- Depois de aspirar o sobrenadante, adicione 2.000 μL de meio RPMI 1640 modificado (Hepes), misture (para ressuspender as células) e repita as etapas de centrifugação e aspiração sobrenadante acima.
- Ressuspenda o pellet (de glóbulos vermelhos corados com membrana plasmática e 2x lavados) com 400 μL de meio RPMI 1640 modificado (Hepes). Rotule o tubo PMS (abreviação de mancha de membrana plasmática).
nota: Alternativamente, o éster succinimidílico de um derivado de rodamina sensível ao pH, que se torna mais fortemente fluorescente em pH ácido, pode ser usado para marcar glóbulos vermelhos humanos. Nesse caso, a intensidade da fluorescência também serve como uma medida da maturação do fagossomo após as partículas terem sido internalizadas.
5. Opsonização (Marcação) de Glóbulos Vermelhos Humanos com Imunoglobulina G (IgG) de Camundongo
- Adicione 1 μL de anticorpo monoclonal (clone HIR2) de camundongo (IgG2b) anti-CD235a humano (1 mg / mL) (armazenado a -20 ° C) ao tubo rotulado como PMS (ver Seções 4.2-4.5), contendo glóbulos vermelhos humanos corados com membrana plasmática suspensos em meio de 400 μL. CD235a (também conhecida como glicoforina A) é uma sialoglicoproteína de membrana específica da linhagem eritróide.
- Incubar a 37 °C durante 8 min. Observar que a opsonização dos glóbulos vermelhos humanos com IgG provoca aglutinação (aglomeração celular). Embora a aglutinação possa servir como um indicador visual de opsonização, ela é indesejável para a imagem de efeitos fagocíticos únicos. Para contornar a aglutinação, misture repetidamente a suspensão celular (a cada 1 min) usando, por exemplo, uma pipeta de volume variável de 20 a 200 μL ajustada para 200 μL.
- No final do período de incubação de 8 minutos, se desejar, lave a lâmina de macrófagos, incubada com anticorpo anti-F4/80 marcado com fluorescência verde, com 1 mL de meio RPMI 1640 modificado (Hepes). Certifique-se de que ambos os reservatórios da corrediça do canal estejam livres do meio após as etapas de lavagem.
6. Imagem da fagocitose de glóbulos vermelhos humanos corados com membrana plasmática e revestidos com IgG
- Após a incubação de 8 minutos com anticorpo anti-CD235a (Seção 5.2), pipete 100 μL de suspensão contendo glóbulos vermelhos humanos corados com membrana plasmática e opsonizados com IgG no canal de uma lâmina contendo macrófagos marcados com anticorpo anti-F4/80 fluorescente verde (Etapa 3). Assim, os glóbulos vermelhos humanos fluorescentes e opsonizados para IgG são adicionados aos fagócitos fluorescentes verdes (macrófagos).
- Assim que os glóbulos vermelhos humanos forem adicionados, monte a lâmina do canal em um microscópio confocal de disco giratório (com a incubadora de platina ajustada para 37 °C) para obter imagens, por exemplo, por meio de uma lente objetiva de imersão em óleo 60X/1,49. Comece a obter imagens o mais rápido possível, pois as partículas começam a se depositar em 1 min.
nota: Usando esferas fluorescentes com diâmetro de 100 nm, medimos, por análise de funções de propagação de pontos, resoluções XY de x = 0,22 μm, y = 0,23 μm (laser de 488 nm) e x = 0,27 μm, y = 0,27 μm (laser de 561 nm). No entanto, para reduzir o fotobranqueamento e a fototoxicidade durante a imagem 3D de lapso de tempo de células vivas, comprometemos a resolução espacial usando binning 2 x 2. O binning aumenta a sensibilidade (melhora a relação sinal-ruído) e a taxa de quadros permitida, mas às custas da resolução espacial.
- Use um sistema de foco perfeito (ou similar) para evitar desvios de foco durante as gravações. Depois de ativar o sistema de foco perfeito, use o controle de deslocamento para focar nas saliências lamelipodiais dos macrófagos imediatamente acima da lamínula (veja a nota abaixo) da lâmina do canal. Este nível de foco corresponde a Z = 0 μm. Obtenha pilhas Z de -1 μm a +16 μm em passos de 0,8 μm, o que equivale a 22 fatias Z. Z-stacks podem, por exemplo, ser obtidos a uma taxa de 1 stack (para cada canal) a cada 15 s para um total de 16 min.
nota: Períodos de gravação mais longos sofrem perdas de qualidade de imagem, principalmente devido ao fotobranqueamento. As pilhas Z são adquiridas para cada um dos dois canais: os macrófagos são fotografados usando um laser de 488 nm (canal verde) e os glóbulos vermelhos humanos são fotografados usando um laser de 561 nm (canal vermelho). Usando essa abordagem, várias visualizações de macrófagos ingerindo glóbulos vermelhos humanos opsonizados por IgG em diferentes momentos podem ser obtidas (por exemplo, ver Figura 2).
nota: As configurações típicas do sistema (com binning 2 x 2) são: canal verde (20,5% de potência do laser (50 mW; 488 nm), sensibilidade de 101 (faixa, 0–255) e tempo de exposição de 200 ms); canal vermelho (10,5% de potência do laser (50 mW; 561 nm), sensibilidade de 101 (intervalo, 0-255) e tempo de exposição de 98 ms).
nota: A parte inferior da corrediça do canal é um polímero com a mesma espessura de uma lamínula de vidro # 1,5 e as mesmas propriedades ópticas do vidro, mas, notavelmente, o material tem a vantagem de permeabilidade ao gás.
