Coloração de acetoximetil de calceína para avaliar a citotoxicidade mediada por células assassinas naturais em células cancerígenas

Resumo

Fonte: Chava, S. et al., Medição da citotoxicidade e migração mediadas por células assassinas naturais no contexto de células tumorais hepáticas. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra um ensaio para medir a citotoxicidade de células natural killer contra células cancerígenas usando a coloração Calcein AM. O número reduzido de células cancerígenas fluorescentes após a co-cultura com células assassinas naturais indica citotoxicidade mediada por células assassinas naturais em relação às células cancerígenas.

Protocolo

1. Método microscópico baseado em coloração de calceína AM para medir a citotoxicidade mediada por células NK

1. Cultive células SK-HEP-1 até 70−80% de confluência. Gere uma suspensão de célula única lavando primeiro as células com 5 mL de 1x PBS seguido de incubação com 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25%.
2. Centrifugue as células SK-HEP-1 em um tubo de centrífuga estéril de 1 mL a 160 x g por 3 min. Ressuspenda o pellet em 3 mL de DMEM sem soro.
3. Adicione 1,5 μL de solução de calceína AM (10 mM) às células SK-HEP-1 e incube por 30 min em temperatura ambiente. Centrifugue células SK-HEP-1 marcadas com calceína AM a 160 x g por 3 min em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL.
4. Lave as células duas vezes com 5 mL de 1x PBS para remover o excesso de corante de calceína AM.
5. Paralelamente, centrifugue as células NK92MI a 160 x g por 3 min em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Lave o pellet celular uma vez com 5 mL de 1x PBS e ressuspenda em 5 mL de meio celular NK92MI.
6. Conte as células SK-HEP-1 marcadas com calceína AM e as células NK92MI usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado.
7. Ressuspenda as células SK-HEP-1 no meio de cultura a 1 x 10⁵ células/mL e as células NK92MI a 1 x 10⁶ células/mL no meio celular NK.
8. Células SK-HEP-1 marcadas com calceína em placa AM (células-alvo) (1 x 10⁴/100 μL/poço) com células NK92MI (células efetoras) (1 x 10⁵/100 μL/poço) (1:10 alvo: proporção efetor) por poço em poços triplicados em uma placa de 96 poços.
9. Incubar as placas de 96 poços a 37 °C em uma atmosfera de 95% de ar e 5% de CO₂ por 4 h. Após a incubação, capture imagens de fluorescência das células marcadas com calceína AM usando um microscópio de fluorescência com ampliação de 10x. Capture pelo menos 10 campos diferentes de cada réplica para cada condição de tratamento.
10. Selecione aleatoriamente 10 imagens para cada réplica e conte as células-alvo marcadas com calceína AM positivas incubadas com ou sem células NK92MI. Calcule a % de citotoxicidade usando a fórmula abaixo.
    
    nota: Como controles, use células-alvo sem células NK92MI e células-alvo completamente lisadas como controle de lise completo. Para lise completa, incube as células em 0,5% de Triton X-100 por 1 h (20 μL de 5% de Triton X-100 em 200 μL de meios de cultura).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Corante Calcein AM	Sigma-Aldrich	Rolamento 17783
DMEM	Gibco	11965-092
Soro fetal bovino	Gibco	26140079
Soro de Cavalo	Gibco	16050114
Células NK92MI	ATCC	CRL-2408
Tampão fosfato salino (PBS)	Sigma-Aldrich	Pág. 4417
Células SKHEP-1	ATCC	HTB-52
Solução de tripsina EDTA	Gibco	25200056