Medição da migração de células assassinas naturais em resposta a estímulos quimiotáticos

Resumo

Fonte: Chava, S., et al. Medição da citotoxicidade e migração mediada por células natural killer no contexto de células tumorais hepáticas. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra um método para estudar a migração de células natural killer (NK) através de um sistema de inserção de membrana porosa em resposta a quimioatraentes. Este método permite a análise quantitativa da migração de células NK usando citometria de fluxo.

Protocolo

1. Ensaio de migração de células NK

1. Cultive células NK92MI e centrifugue células a 160 x g por 3 min em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL.
2. Lave o pellet celular duas vezes com 5 mL de 1x PBS e ressuspenda as células em 3 mL de meio celular NK92MI sem soro. Conte as células NK92MI usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado.
3. Células NK92MI da placa (2,5 x 10,⁵ células/100 μL/poço) no compartimento superior da câmara permeável do transwell (inserção de 6,5 mm de diâmetro e tamanho de poro de 5 μm).
4. Na câmara inferior, adicione 0,6 mL de material contendo meio sem soro a ser testado quanto às propriedades quimioatraentes das células NK (por exemplo, meio condicionado, quimiocinas, citocinas).
   nota: Ao preparar o meio condicionado, use meio de soro reduzido sem adição de soro para eliminar a interferência das proteínas séricas no ensaio de migração.
5. Incubar as câmaras permeáveis de 24 poços a 37°C durante 4 h. Após 4 h, colete as células NK92MI não aderentes e migradas da câmara inferior e transfira-as para tubos de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para análise posterior.
   nota: O tempo de cultura pode variar dependendo do tipo de células-alvo, bem como da quantidade e cinética das quimiocinas produzidas pelas células-alvo. Portanto, esse tempo deve ser determinado empiricamente para cada tipo de célula, quimiocina e experimento.
6. Adicione um número predeterminado de grânulos de contagem para citometria de fluxo em um volume de 50 μL a cada tubo contendo células NK migradas. Avalie o volume de 300 μL/suspensão de células de poço usando qualquer citômetro de fluxo capaz de contagem automatizada de células baseada em FACS.
   nota: Misture ou misture em vórtice os grânulos de contagem para citometria de fluxo completamente a cada vez antes de usar para garantir que um número constante de grânulos seja usado para minimizar a variabilidade experimental. A pipetagem reversa é recomendada com grânulos de contagem para manter a precisão. Use apenas células NK e contas de contagem para citometria de fluxo como controles de análise FACS. Os autores recomendam a leitura de pelo menos 10.000 contas + células NK combinadas, uma quantidade que funcionou bem. No entanto, esse número pode variar dependendo das condições experimentais. Portanto, o número combinado de grânulos + células NK deve ser determinado empiricamente para cada tipo de experimento. Além disso, é importante realizar experimentos usando triplicados biológicos para obter resultados estatisticamente significativos e levar em conta a variabilidade entre diferentes contagens de células.
7. Calcule o número absoluto de células NK92MI migradas usando esta fórmula:
   
   onde A = número de células, B = número de contas, C = contagem de contas atribuídas do lote (número de contas de contagem para citometria de fluxo/50 μL; neste exemplo 49.500) e D = volume da amostra (μL).
   nota: Se 300 μL de volume de amostra (células migradas) forem usados para análise FACS com 50 μL de contas de contagem para citometria de fluxo, o número absoluto de células migradas = 1.700 células/3.300 eventos de contas x 49.500 contas/300 μL = 84,975 células/μL. O cálculo deve ser corrigido se a amostra for diluída ou se for utilizado um volume diferente de esferas de contagem FACS.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Contas de contagem absoluta	Thermo Fisher Científico	C36950
Células NK92MI	ATCC	CRL-2408
Células SKHEP-1	ATCC	HTB-52
Câmaras permeáveis a transwell	Costar	3241
Opti-MEM	Gibco	31985070
Tampão fosfato salino (PBS)	Sigma-Aldrich	Pág. 4417
Alfa-MEM	Sigma-Aldrich	M4256