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1. Prepare o complemento e as bactérias-alvo
- Prepare o complemento de coelho bebê (BRC)
NOTA: Critérios detalhados para seleção de lotes complementares podem ser encontrados aqui: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
- Obtenha BRC congelado e descongele com água fria corrente. Misture fisicamente o BRC a cada ~ 10-20 min até descongelar completamente. Não sujeite o BRC a ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
- Enquanto o BRC está descongelando, rotule os tubos de centrífuga de 1,5 mL, 5 mL ou 15 mL. Coloque os tubos rotulados no gelo para pré-esfriar. Alíquota do volume adequado BRC para os tubos de centrífuga pré-resfriados (após o enchimento, retorne imediatamente cada tubo ao gelo). Armazene as alíquotas a ≤ -70 °C no freezer.
nota: Aproximadamente 1 mL de complemento é necessário para cada placa de ensaio. As alíquotas complementares destinam-se a utilização única e devem ser alíquotas em volumes adequados aos esquemas de ensaio.
- Para preparar o BRC inativado por calor, descongele uma alíquota de BRC ativo. Preparar um banho-maria a 56 °C. Depois que o BRC estiver completamente descongelado, transfira-o para o banho-maria e incube por 30 min.
- Após a incubação, remova o BRC inativado por calor do banho-maria e deixe-o esfriar em temperatura ambiente (RT) por 10-15 min. Misture vigorosamente e alíquota ~ 150 μL a 1,5 mL de tubos de microcentrífuga. Armazenar alíquotas a ≤ -10 °C.
- Preparar estoque de bactérias-alvo
NOTA: O procedimento abaixo é usado para preparar 48 alíquotas de estoque de bactérias-alvo; Se forem necessárias mais alíquotas, o protocolo pode ser ampliado.
- Remova o frasco para injetáveis de estoque principal de bactérias do freezer e raspe a superfície bacteriana congelada para remover uma pequena quantidade de gelo do frasco para uma placa de ágar sangue. Devolva imediatamente o frasco para injetáveis principal ao congelador.
- Listre esta pequena alíquota de estoque bacteriano na placa de ágar sangue e cubra-a com a tampa da placa. Incubar a placa de cabeça para baixo durante a noite em uma incubadora a 37 °C/5% de CO2.
- Transfira ~ 10 colônias lisas isoladas para um tubo de 50 mL contendo 30 mL de caldo LB. Incubar durante 3-5 h a 37 °C com agitação suave até que o caldo de cultura tenha uma OD600 de ~0,6-0,7.
- Colha os 12,5 mL superiores da cultura e transfira para um novo tubo de 50 mL. Centrifugue a cultura a 15.000 x g por 2 min usando uma microcentrífuga de mesa. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 25 mL de glicerol estéril a 15%.
- Misture bem e dispense alíquotas de 0,5 mL em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mL (~ 48 tubos). Armazenar alíquotas a ≤ -70 °C no congelador.
- Confirmar a identidade bacteriana utilizando o teste de aglutinação antes da utilização.
- Determinação do fator de diluição ótimo para o estoque de bactérias-alvo
NOTA: Cada lote de estoque de bactérias-alvo deve ser titulado em condições de ensaio para determinar a diluição necessária para produzir ~ 120 UFC/ponto em placas LB.
- Obtenha uma placa de microtitulação (placa de diluição) e adicione 135 μL de tampão de ensaio ao poço 1A. Adicione 120 μL de manteiga de ensaio aos poços 1B-1H.
- Remova um frasco de bactérias-alvo congeladas do freezer e descongele em temperatura ambiente. Adicione 15ul de estoque bacteriano descongelado ao poço 1A para fazer uma diluição de 10 vezes do estoque bacteriano.
- Transfira 30 μL de solução bacteriana do poço 1A para o poço 1B para realizar uma diluição serial de 5 vezes. Continue as diluições seriadas de 5 vezes até o poço 1H para um total de 8 diluições (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1: 31 250; 1: 156 250; 1:781 250).
- Obtenha outra placa de microtitulação (Placa de Ensaio) e adicione 20 μL de tampão de ensaio a todos os poços nas colunas 1 e 2 da Placa de Ensaio.
- Transfira 10 μL de bactérias diluídas de cada poço na coluna 1 da placa de diluição para os poços correspondentes nas colunas 1 e 2 da placa de ensaio. 10 μL de bactérias são transferidos do poço 1A da placa de diluição para o poço 1A e 2A na placa de ensaio, etc.
- Continue com o ensaio conforme descrito no Ensaio Bactericida Sérico (SBA) abaixo para o Controle A e o Controle B, etapas 3.6-3.12.
- Depois que as placas forem incubadas no gelo, use uma pipeta multicanal com 8 pontas de pipeta para localizar 10 μL dos poços na coluna 1 em uma placa LBA. Além disso, localize os poços da coluna 2 na placa LBA.
- Continue com o ensaio conforme descrito abaixo nas etapas 3.14-4.6.
- Determine a diluição da bactéria que produz ~ 120 UFC/ponto no Controle B, esta diluição será usada no ensaio.
2. Ensaio bactericida sérico (SBA)
NOTA: O procedimento descrito abaixo é para uma placa de ensaio, mas o número de placas de ensaio pode ser aumentado.
- Amostras de teste de inativação térmica por incubação em banho-maria a 56 °C por 30 min.
nota: As amostras de ensaio devem ser inactivadas pelo calor antes do ensaio, a fim de anular qualquer actividade endógena do complemento. Isso pode ser feito antes do ensaio e as amostras inativadas podem ser congeladas novamente ou armazenadas a 4 °C até serem testadas.
- Obtenha uma placa de ensaio e adicione 20 μL de tampão de ensaio às colunas 1 a 12 das linhas A a G. Adicione 20 μL de tampão de ensaio às colunas 1 e 2 da linha H, consulte a Tabela 1.
- Carregar 30 μL de cada amostra de ensaio, em duplicado, na linha H da placa de ensaio. Por exemplo, dispense 30 μL da amostra 1 nos poços 3H e 4H, e dispense 30 μL da amostra 2 nos poços 5H e 6H, etc.
- Realize diluições seriais de 3 vezes de amostras de teste usando uma pipeta multicanal.
- Remova 10 μ da amostra dos poços 3H-12H e transfira-a para os poços correspondentes na linha G e misture o poço da amostra pipetando para cima e para baixo 8 a 10 vezes.
- Em seguida, remova 10 μ dos poços 3G-12G e transfira para os poços correspondentes na linha F e misture bem.
- Continuar estas diluições em série através da linha A. Depois de misturar os alvéolos na linha A, remova e descarte 10 μl dos alvéolos 3A-12A para que todos os alvéolos contenham 20 μl.
nota: Como 20 μL de soro são usados em um volume total de ensaio de 80 μL, há uma diluição adicional de 4 vezes no ensaio. Esta diluição deve ser tida em conta durante o cálculo de um título de SBA, multiplicando a diluição do soro por 4. Por exemplo, se for utilizada uma diluição inicial de 1:2, a diluição real a ser ensaiada é de 1:8.
- Remova um frasco de estoque de bactérias-alvo congelado e descongele em temperatura ambiente. Diluir as bactérias em 20 ml de tampão de ensaio de acordo com o fator de diluição óptimo pré-determinado (este factor de diluição foi determinado na secção 1.3). Adicione 10 μL de bactérias diluídas a cada poço da placa de ensaio usando uma pipeta multicanal.
- Remova um frasco de BRC congelado e um frasco de BRC inativado por calor congelado, descongele em temperatura ambiente com água fria corrente ou coloque na grelha de um gabinete de segurança biológica com sopro de ar para descongelar rapidamente.
- Prepare uma solução a 20% de BRC inativado por calor. Misture 100 μL de BRC inativado por calor com 400 μL de tampão de ensaio. Adicione 50 μL desta solução de BRC inativada por calor a 20% a todos os poços na coluna 1 (poços de controle A).
nota: O BRC inativado por calor é usado como controle para monitorar a morte não específica (NSK) no ensaio.
- Prepare uma solução a 20% de BRC nativo. Misture 1 mL de BRC nativo com 4 mL de tampão de ensaio. Adicione 50 μL desta mistura a todos os poços nas colunas 2 a 12 (controle B e poços de amostra de teste).
nota: A concentração final de BRC na mistura de reação é de 12,5%.
- Misture brevemente a placa de ensaio agitando suavemente por 10-15 s em um agitador de placas ou misture pipetando para cima e para baixo 8 vezes usando uma pipeta multicanal.
- Colocar a placa de ensaio numa incubadora microbiológica a 37 °C durante 2 h (sem agitação).
- Seque 2 placas LBA removendo as tampas e colocando as placas voltadas para cima no gabinete de segurança biológica por 40-60 min.
- Quando a incubação de 2 h estiver concluída, mova a placa de ensaio para gelo úmido e incube por 10-20 min para interromper a reação.
- Usando uma pipeta de 12 canais, misture os poços na linha H e coloque 10 μL da mistura de reação no fundo de uma placa de LBA. Incline imediatamente a placa e deixe as manchas correrem por ~ 1.5-2 cm. Repita este procedimento para as linhas G, F e E, identificando-as acima da linha anterior na placa LBA. As linhas E, F, G e H são identificadas em uma placa LBA e as linhas A, B, C e D são identificadas em uma segunda placa LBA da mesma maneira, consulte a Figura 1.
- Incube as placas de LBA à temperatura ambiente até que a solução seja adsorvida nas placas de LBA (10-15 min). Coloque as tampas nas placas de LBA e coloque as placas de LBA na incubadora microbiológica de cabeça para baixo para incubar durante a noite (~16-18 h). Incubar Shigella flexneri 2a e 3a a 29 °C e incubar S. sonnei a 26 °C.
nota: Essas temperaturas produzem "microcolônias" menores com tamanhos adequados para contagem precisa por um contador de colônias9.
- Após a incubação durante a noite, adicione 25 mL de ágar overlay (a ~ 55 ° C) contendo 100 μg / mL TTC e 0,1% NaN3 a cada placa de LBA.
- Incubar as placas de LBA a 37 °C durante 2 h para permitir que as bactérias sobreviventes desenvolvam uma cor vermelha, ver figura 1 abaixo.
- Fotografe as placas usando uma câmera digital e transfira as imagens para um computador onde o Integrated Colony Enumerating Software (NICE) do NIST foi instalado, consulte a Figura 2.
nota: O software de contagem de colônias NICE está disponível gratuitamente. Consulte a Lista de Materiais para obter detalhes e instruções de instalação.
Tabela 1: Layout da placa de ensaio. As colunas 1 e 2 contêm os alvéolos de controlo do complemento. O controle A está localizado na coluna 1 e é o controle do complemento inativado pelo calor, contendo tampão SBA, bactérias e complemento inativado pelo calor. O controle B está localizado na coluna 2 e é o controle ativo do complemento, contendo tampão SBA, bactérias e complemento. As colunas 3-12 contêm amostras de soro. Cada amostra é executada em duplicata e diluída em série 3 vezes da linha H para a linha A
| 1 | algarismo | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| um | Controle A | Controle B | Diluição 8 | Diluição 8 | Diluição 8 | Diluição 8 | Diluição 8 | Diluição 8 | Diluição 8 | Diluição 8 | Diluição 8 | Diluição 8 |
| O | Controle A | Controle B | Diluição 7 | Diluição 7 | Diluição 7 | Diluição 7 | Diluição 7 | Diluição 7 | Diluição 7 | Diluição 7 | Diluição 7 | Diluição 7 |
| O | Controle A | Controle B | Diluição 6 | Diluição 6 | Diluição 6 | Diluição 6 | Diluição 6 | Diluição 6 | Diluição 6 | Diluição 6 | Diluição 6 | Diluição 6 |
| D | Controle A | Controle B | Diluição 5 | Diluição 5 | Diluição 5 | Diluição 5 | Diluição 5 | Diluição 5 | Diluição 5 | Diluição 5 | Diluição 5 | Diluição 5 |
| E | Controle A | Controle B | Diluição 4 | Diluição 4 | Diluição 4 | Diluição 4 | Diluição 4 | Diluição 4 | Diluição 4 | Diluição 4 | Diluição 4 | Diluição 4 |
| O | Controle A | Controle B | Diluição 3 | Diluição 3 | Diluição 3 | Diluição 3 | Diluição 3 | Diluição 3 | Diluição 3 | Diluição 3 | Diluição 3 | Diluição 3 |
| O | Controle A | Controle B | Diluição 2 | Diluição 2 | Diluição 2 | Diluição 2 | Diluição 2 | Diluição 2 | Diluição 2 | Diluição 2 | Diluição 2 | Diluição 2 |
| H | Controle A | Controle B | Diluição 1 | Diluição 1 | Diluição 1 | Diluição 1 | Diluição 1 | Diluição 1 | Diluição 1 | Diluição 1 | Diluição 1 | Diluição 1 |
| | | Exemplo 1 | Exemplo 2 | Exemplo 3 | Exemplo 4 | Exemplo 5 |
