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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de timócitos apoptóticos marcados com CFSE
- Eutanasiar dois camundongos C57 / B6 virgens por inalação de CO2 por 10 min e dissecar para abrir a cavidade torácica, remover (retirar) o timo com pinças curvas de ponta fina em placa de Petri de cultura de tecidos contendo 10 mL de RPMI1640 meio.
- Obtenha uma suspensão unicelular triturando todo o timo contra duas extremidades foscas das lâminas do microscópio e, em seguida, filtre a suspensão através de um filtro de células de 100 μm.
- Colete a suspensão de timo de 10 mL em um tubo de 50 mL e centrifugue a 300 x g por 5 min.
- Remova o sobrenadante, ressuspenda em 40 mL de PBS 1x e conte o número de células com um hemocitômetro.
- Centrifugue a 300 x g durante 5 min e retire o sobrenadante.
- Ressuspenda em 20 mL de 1x PBS em um tubo de 50 mL como uma suspensão de célula única com até 2 x 108 células (se mais de 2 x 108 células, ressuspenda o restante das células em outros 20 mL de 1 x PBS em um tubo diferente de 50 mL).
- Faça 5 μM de CFSE em igual volume (20 mL) de 1x PBS em um tubo separado de 50 mL pipetando 40 μL de solução estoque CFSE (2,5 mM) em 20 mL de 1x PBS e misture bem invertendo o tubo 2 a 3 vezes.
- Adicione os 20 mL de CFSE da etapa 1.7 aos 20 mL de suspensão celular da etapa 1.6 (a concentração final de CFSE agora é de 2,5 μM).
nota: Para cada suspensão de célula de 20 mL, é necessário um tubo CFSE de 20 mL.
- Inverta a célula e o tubo de mistura CFSE 2 a 3 vezes e incube a mistura no escuro à temperatura ambiente por no máximo 2 min, depois pare a reação adicionando 10 mL de soro de cavalo inativado pelo calor.
- Centrifugue a mistura de tubos de 50 mL a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente.
nota: Se a rotulagem CFSE for bem-sucedida, o pellet celular ficará amarelo claro.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 40 mL de PBS 1x e conte o número de células com um hemocitômetro.
- Centrifugar a suspensão celular a 300 x g durante 5 min e rejeitar o sobrenadante.
- Lave novamente o pellet celular com 40 mL de RPMI1640 meio.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda as células com RPMI1640 meio de cultura de tecidos (RPMI1640, HEPES 20 mM, FBS 10% (inativado pelo calor), glutamina 20 mM e 1x Pen/Strep) a uma concentração de 7 x 106 células/mL em uma placa de cultura de tecidos de 100 mm.
nota: Se forem obtidas mais células, será necessária uma placa de cultura de tecidos separada de 100 mm.
- Adicionar estaurosporina à cultura em suspensão celular a uma concentração final de 1 μM e cultivar durante 4 h a 37 °C numa incubadora de cultura de tecidos abastecida com 5% de CO2.
2. Preparação de macrófagos peritoneais
- Injete dois camundongos C57B6 (ou qualquer camundongo manipulado por genes no laboratório) por via intraperitoneal com 1 mL de tioglicolato envelhecido a 3% no dia 0.
- Eutanásia dos camundongos no dia 5 como na etapa 1.1, corte e descasque a pele abdominal, mas deixe o peritônio intacto. Lave a cavidade peritoneal empurrando rapidamente 10 mL de tampão de lavagem (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) na cavidade peritoneal usando uma seringa de 10 mL conectada a uma agulha de 18 G.
- Recupere o tampão de lavagem lentamente com a mesma agulha / seringa e colete o tampão de lavagem em um tubo de 50 mL.
- Lave a gavagem peritoneal duas vezes com 1x PBS, ressuspenda os macrófagos peritoneais em RPMI1640 meio de cultura de tecidos a uma densidade de 2 x 106 células/mL e alíquota de 500 μL em cada poço da placa de 24 poços. Deixe a placa em uma incubadora de cultura de tecidos por 2 h.
- Remover as células flutuantes aspirando-as e substituindo-as por 500 μL de meio de cultura fresco, duas vezes.
- Opcionalmente, adicione o inibidor de tirosina do receptor TAM, RXDX-106, nas concentrações indicadas nas legendas das figuras em cada poço da cultura de macrófagos e incube por mais 2 h.
3. Co-cultura de macrófagos peritoneais com timócitos apoptóticos
- Colete timócitos apoptóticos da etapa 1 e lave três vezes com RPMI1640 meio. A eficiência da indução apoptótica pode ser medida nesta fase com o kit Annexin V/7-AAD.
- Distribua 0 - 12 x 106 células (em meio de 500 μL) em cada poço das culturas de macrófagos do protocolo # 2, de acordo com o arranjo experimental (por exemplo, veja a Figura 1). Isso faz com que todo o volume de cultura seja de 1 mL em cada poço da placa de 24 poços. Adicione o anticorpo bloqueador à cultura imediatamente antes da adição de timócitos apoptóticos.
- Cultivar a mistura celular a 37 °C durante 4 h numa incubadora de cultura de tecidos abastecida com 5% de CO2.
- Lave cada poço da cultura com 1x PBS (contendo 500 μM de EDTA) duas vezes para remover as células apoptóticas flutuantes.
- Manchar os macrófagos ligados à placa com CD11b-PE nesta fase.
- Lave os macrófagos ligados à placa com um tampão de coloração (1x PBS, 1% BSA) uma vez.
- Adicione 200 μL de tampão de coloração contendo 2 μL de CD11b-PE em cada poço.
- Incubar a placa a 4 °C durante 20 min.
- Lave cada poço da placa três vezes com o tampão de coloração.
- Adicione 200 μL de tampão de coloração e prossiga com a placa para análise de imagem sob o microscópio fluorescente.
