Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Coleta de soro
- Colete amostras de soro de humanos em pontos de interesse. Para este estudo, coletamos soros nos dias 0 (momento da vacinação contra influenza), +7, +30, +60 e +180 após a vacinação.
- Para obter o soro, centrifugue os tubos de amostra a 1.200 x g por 10 min em temperatura ambiente (20 - 25 °C).
nota: As amostras de sangue não centrifugadas devem ser conservadas a 4 °C e durante um período máximo de 24 horas.
- Aliquotar o soro em diferentes tubos (frascos criogênicos) e congelar a -80 °C até o uso.
- Realize os ensaios subsequentes em lote, incluindo todos os pontos de tempo de uma pessoa para reduzir a variabilidade dentro de um paciente.
2. Preparação de antigénios
CUIDADO: Cinco antígenos diferentes são usados (consulte a Tabela de Materiais). Prepare antígenos em um laboratório de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2).
- De acordo com as instruções do fabricante, reconstitua o conteúdo total de uma ampola de antígeno influenza liofilizada com 1,0 mL de água destilada e deixe o antígeno dissolvido repousar por no mínimo 5 min em temperatura ambiente antes de prosseguir.
- Alíquota da solução de antigénio para tubos de 1,5 ml e congelar a -80 °C até nova utilização.
3. Preparação do Filtrado de Cólera
NOTA: O filtrado de cólera é usado como uma enzima destruidora de receptores (RDE) de acordo com o protocolo da Organização Mundial da Saúde (OMS). Isso remove os inibidores inatos do soro que interfeririam no ensaio.
- Reconstitua o RDE liofilizado de acordo com as instruções do fabricante.
- Conservar a solução RDE num tubo de 15 ml a 4 °C até nova utilização.
4. Ensaio HA
NOTA: Para garantir que os ensaios de inibição da hemaglutinação (HI) sejam comparáveis entre várias placas, a mesma quantidade de partículas de vírus deve ser usada para cada placa. O ensaio de hemaglutinação (HA) (também chamado de titulação de HA) é realizado para quantificar as partículas virais necessárias para a hemaglutinação e é registrado em unidades de HA. Uma "unidade" de hemaglutinação é uma unidade operacional dependente do método usado para titulação de AH e não é uma medida de uma quantidade absoluta de vírus. Assim, uma unidade de AH é definida como a quantidade de vírus necessária para aglutinar um volume igual de uma suspensão padronizada de hemácias. De acordo com a OMS, a quantidade padrão usada para o ensaio HI é de 4 unidades de HA por 25 μL. Para uma ilustração do princípio do ensaio HA, consulte a Figura 1.
NOTA: Os glóbulos vermelhos (hemácias) utilizados dependem do tipo de vírus da gripe no ensaio (Tabela 1). Além disso, para vários tipos de placas de microtitulação de 96 poços, o tempo de incubação, bem como a aparência das células não aglutinadas, diferem (Tabela 2).
- Preparação da suspensão do RBC
- Diluir a suspensão de reserva de hemácias (10%, v/v; excepto humano tipo O) (ver Tabela de Materiais) com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para obter as concentrações adequadas para as hemácias de aves e mamíferos de 0,75% e 1%, respectivamente.
- Preparação da placa de microtitulação de 96 poços
NOTA: Consulte a Figura 2 para obter uma visão geral do design da placa.
- Adicione 25 μL de PBS aos poços 1 a 12 de cada fileira usada de uma placa de microtitulação de 96 poços usando uma pipeta multicanal (Figura 2). Use a placa de microtitulação em forma de V ao trabalhar com hemácias aviárias, como frango e peru. Use a placa de microtitulação em forma de U ao trabalhar com hemácias de mamíferos, como cobaias e humanos tipo O (Tabela 2).
- Adicione 25 μL de antígeno influenza ao primeiro poço das fileiras de antígenos, que são organizadas em duplicatas. Nenhum antígeno é adicionado às linhas de controle. As linhas de controle não devem apresentar efeito de hemaglutinação e servir como controles negativos (Figura 2).
- Efectuar uma diluição de 2 vezes em série transferindo 25 μL do primeiro alvéolo das filas de antigénios para alvéolos sucessivos utilizando uma pipeta multicanal. Misturar cada etapa de diluição pipetando suavemente 10 vezes para cima e para baixo.
- Rejeitar os 25 μL finais dos últimos alvéolos.
- Adicione 25 μL de PBS aos poços 1 a 12 de cada fileira usada usando uma pipeta multicanal, para atingir um volume total de 50 μL por poço.
- Adicione 50 μL da suspensão de hemácias a cada poço usado usando uma pipeta multicanal.
- Bata no prato com cuidado 10 vezes nos quatro lados para misturar.
- Cubra a placa com uma tampa e incube à temperatura ambiente durante o período de tempo adequado, dependendo das espécies de hemácias utilizadas (ver Tabela 2). Não mova a placa durante a incubação.
- Lendo a placa
NOTA: A leitura é ligeiramente diferente quando se utilizam eritrócitos aviários em comparação com os eritrócitos de mamíferos, devido aos diferentes poços de microtitulação (Figura 3).
- Leitura de hemácias aviárias
- Incline a placa 90° por 25 s.
nota: O ponto final de titulação do AH é o último poço onde ocorre a hemaglutinação completa. Este poço contém 1 unidade HA de vírus. Devido às diluições 2 vezes do antígeno, dois poços à frente do ponto final de titulação do HA está o poço que contém 4 unidades de HA do vírus (Figura 4).
- Marque os resultados imediatamente, enquanto a placa ainda está na posição inclinada, em um esquema impresso da placa de 96 poços. Os padrões de aglutinação das hemácias aviárias são mostrados na Figura 3.
- Leitura de hemácias de mamíferos
- Marque os resultados em um esquema impresso da placa de 96 poços, sem inclinar a placa (posição horizontal na bancada).
nota: Quando ocorre hemaglutinação, as células aglutinadas não se depositam no fundo, enquanto as células não aglutinadas aparecem como um halo no fundo do poço. O halo das células parcialmente aglutinadas é menos intenso e tem maior diâmetro (Figura 3).
- Determinação de 4 unidades de HA.
nota: Inclinar a placa é crucial para a diferenciação dos padrões aviários porque todos os três tipos diferentes de padrões de aglutinação (completamente aglutinado, parcialmente aglutinado e não aglutinado) aparecem como um botão quando não estão inclinados.
5. Ensaio HI
NOTA: O fluxo de trabalho do protocolo foi otimizado para permitir um manuseio mais eficiente de várias amostras ao mesmo tempo, usando listras de tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR) e um termociclador (veja abaixo).
- Preparação das amostras de soro
nota: Prepare amostras de soro em um laboratório de nível de biossegurança 2 (BSL-2).
- Descongele as amostras de soro congeladas de cada ponto de tempo de cada pessoa (consulte a etapa 1.2) em temperatura ambiente.
- Adicionar uma alíquota de 10 μL de cada amostra de soro descongelada a um tubo de tira de tubo PCR (10 tubos numa tira).
nota: A grande vantagem de usar tiras de tubo de PCR é que uma pipeta multicanal pode ser usada para as seguintes etapas do ensaio HI; Isso economiza muito tempo ao testar um grande número de amostras de soro e ao realizar medições repetidas das mesmas amostras para títulos de anticorpos contra diferentes cepas de vírus.
- Conservar as amostras de soro alíquota nas tiras de tubos de PCR a -80 °C até à utilização.
- Um dia antes da realização do ensaio HI, descongelar as alíquotas da amostra de soro de interesse à temperatura ambiente.
- Adicione 10 μL do anti-soro apropriado a um tubo de PCR vazio.
nota: Para servir como controle positivo, o anti-soro contra um vírus específico deve corresponder ao vírus usado. O controle positivo permite a padronização do desempenho da chapa em várias chapas.
- Adicionar 30 μL de solução de filtrado de cólera a cada alíquota de soro e ao anti-soro (3 volumes de filtrado de cólera para 1 volume de soro) usando uma pipeta multicanal.
- Mantenha os tubos de PCR em um rack de PCR de 96 poços ou em uma caixa de ponta vazia e vórtice por 5 s.
- Incubar as amostras durante a noite a 37 °C utilizando um termociclador.
- Incubar as amostras a 56 °C durante 30 min para inactivar o filtrado de cólera utilizando um termociclador.
nota: Dependendo do termociclador, esta etapa pode ser programada para automatizar ainda mais o processo.
- Mantenha os tubos de PCR em um rack de PCR de 96 poços ou em uma caixa de ponta vazia e vórtice por 5 s.
- Conservar as amostras a 4 °C no frigorífico até à utilização para o ensaio HI.
- Ensaio HI
nota: Para uma ilustração do princípio do ensaio HI, consulte a Figura 1. Dependendo do vírus, diferentes espécies de hemácias são usadas para o ensaio (Tabela 1). As diferentes espécies de hemácias são usadas em vários tipos de placas de 96 poços, e o tempo de incubação, bem como a aparência das células não aglutinadas, diferem (Tabela 2). Para o ensaio HI, 4 unidades HA de vírus ou antígeno são adicionadas à série de diluição de 2 vezes das amostras.
- Preparação da solução de antigénio
- Calcule o volume de solução de antígeno necessário de acordo com o número de placas de 96 poços usadas (25 μL de antígeno por poço × 96 = 2.400 μL de antígeno por placa de 96 poços; adicione 100 μL por placa extra devido ao uso de um reservatório para a pipeta multicanal; um total de 2,5 mL de antígeno por placa).
nota: Por exemplo, se medir 100 amostras de soro, são necessárias 10 placas (10 amostras por placa): 2,5 mL x 10 = 25 mL de solução de antígeno necessária no total.
- Preparar a diluição adequada de 4 unidades de HA para o volume calculado usando PBS.
NOTA: 4 unidades de HA são determinadas para o ensaio de HA. Para a quantidade adequada de antigénio, dividir o volume calculado pelo título correspondente a 4 unidades de HA. Por exemplo, 4 unidades de HA correspondem a uma diluição de 1/64, e precisamos de 15.000 μL de solução de antígeno: 15.000/64 = 234,4 μL do antígeno de influenza liofilizado dissolvido são adicionados.
- Preparação da suspensão dos eritrócitos
- Calcule o volume de suspensão de hemácias necessário de acordo com o número de placas de microtitulação de 96 poços usadas (suspensão de 50 μL de hemácias por poço × 96 = 4.800 μL de suspensão de hemácias por placa de 96 poços; adicione 200 μL por placa extra devido ao uso de um reservatório para a pipeta multicanal).
- Diluir a suspensão de estoque de hemácias (normalmente 10%, v/v; exceto humano tipo O) com PBS para obter as concentrações adequadas para hemácias de aves e mamíferos de 0,75% e 1%, respectivamente.
- Preparação da placa de microtitulação de 96 poços
- Rotule as placas de microtitulação de 96 poços (ID da amostra, controle positivo e titulação reversa). Verifique cuidadosamente a orientação da placa na Figura 5.
- Adicione 25 μL de PBS a cada poço, exceto ao primeiro poço da linha de "titulação reversa" (Figura 5, 12ª linha) usando a pipeta multicanal.
nota: Uma titulação reversa foi realizada para verificar se a diluição do antígeno utilizada é igual a 4 unidades de HA. Um título de antígeno de 4 unidades de HA é indicado se a hemaglutinação ocorrer nos três primeiros poços da linha de "titulação reversa", mas não no quarto poço.
- Adicionar 50 μl da solução de antigénio preparada (descrita no ponto 5.2.1) ao primeiro alvéolo da linha de "titulação inversa" (12.a carreira).
- Adicionar 25 μL de amostras de soro tratadas com RDE aos primeiros alvéolos das fileiras 1 a 10 de cada placa, utilizando a pipeta multicanal.
- Adicionar 25 μL do anti-soro adequado ao primeiro alvéolo da11.ª fileira como controlo positivo.
- Realize diluições seriais de 2 vezes transferindo 25 μL do primeiro poço de cada linha (1 - 12) para poços sucessivos usando uma pipeta multicanal. Misturar pipetando 10 a 15 vezes para cada etapa de diluição. As mesmas pontas podem ser usadas para cada etapa de diluição por amostra.
- Rejeitar os 25 μL finais dos últimos alvéolos.
- Adicionar 25 μl da solução de antigénio utilizando uma pipeta multicanal a cada alvéolo das filas 1 a 11 (amostras de soro e anti-soro). As mesmas pontas podem ser usadas se não tocarem nos poços.
- Adicione 25 μL de PBS em vez de antígeno a cada poço da linha de "titulação reversa" (12ª linha).
- Bata no prato com cuidado 10 vezes nos quatro lados para misturar.
- Cubra o prato com uma tampa e incube em temperatura ambiente por 30 min. Não mova a placa durante a incubação.
- Adicione 50 μL da suspensão de hemácias a cada poço.
- Bata no prato com cuidado 10 vezes nos 4 lados para misturar.
- Cubra a placa com uma tampa e incube à temperatura ambiente durante o período de tempo adequado, dependendo das espécies de hemácias utilizadas (ver Tabela 2). Não mova a placa durante a incubação.
- Lendo a placa
nota: O título de HI é o recíproco da última diluição do (anti) soro que inibe completamente a hemaglutinação. É importante considerar que os soros tratados com RDE já foram diluídos 1:4 e após a etapa de diluição seriada, os soros nos primeiros poços são diluídos 1:8, o que corresponde a um título de HI de 8.
- Leitura de hemácias aviárias
- Incline a placa 90° por 25 s.
nota: Inclinar a placa é crucial para a diferenciação dos padrões aviários porque todos os três tipos diferentes de padrões de aglutinação (completamente aglutinado, parcialmente aglutinado e não aglutinado) aparecem como um botão quando não estão inclinados.
- Marque os resultados imediatamente, enquanto a placa ainda está na posição inclinada, em um esquema impresso da placa de 96 poços. Os padrões de aglutinação das hemácias aviárias são mostrados na figura 3.
Tabela 1: Antígenos da gripe e espécies correspondentes de hemácias. De acordo com as instruções do fabricante (NIBSC).
| Antígeno da gripe | A/Califórnia/7/09 (H1N1) | A/Suíça/9715293/2013 (H3N2) | A/Texas/50/2012 (H3N2) | B/Brisbane/60/08 | B/Massachusetts/02/2012 |
| Espécies de hemácias | frango | cobaia | cobaia | Turquia | Turquia |
Tabela 2: Condições de ensaio com diferentes espécies de hemácias.De acordo com o protocolo da OMS. (* flui quando inclinado).
| Espécies de hemácias | frango | Turquia | cobaia | Tipo humano O |
| Concentração de hemácias (v/v) | 0,75% | 0,75% | 1% de sucesso | 1% de sucesso |
| Tipo de placa de microtitulação | V inferior | V inferior | Você está embaixo | Você está embaixo |
| Tempo de incubação, RT | 30 min | 30 min | 1 hora | 1 hora |
| Aparecimento de células não aglutinadas | botão* | botão* | halo | halo |
