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1. Polarização do HMDM
- Em condições estéreis, prepare o meio de preparação M1 adicionando interferon γ (IFNγ; 20 ng / mL) e lipopolissacarídeo (LPS; 1 μg / mL) ao meio de cultura RPMI-1640 completo. Prepare o meio de escorva M2 adicionando interleucina 4 (IL-4; 20 ng/mL) ao meio de cultura RPMI-1640 completo.
- Em condições estéreis, aspirar os meios dos alvéolos da placa de cultura de tecidos que contêm os macrófagos derivados de monócitos humanos, HMDM, que foram semeados e cultivados conforme descrito na secção 1.
- Lave cuidadosamente os poços contendo as células 3x com PBS estéril (pré-aquecido a 37 °C), usando alíquotas de 1 mL de PBS.
- Adicione 1 mL do meio de escorva M1 ou M2 a cada poço contendo o HMDM (o que for apropriado para o experimento).
- Incubar as células durante 48 h a 37 °C na presença de CO2 a 5% numa incubadora de células.
2. Estimulação do HMDM para induzir a liberação de MET
- Em condições estéreis, preparar os meios de cultura que contenham diferentes estimuladores de armadilhas extracelulares de macrófagos libertados por MET (consoante o que for adequado para a experiência) para os meios RPMI-1640 completos: PMA (25 nM), TNFα recombinante humano (25 ng/ml) ou IL-8 recombinante humano (50 ng/ml).
- Para experimentos com ácido hipocloroso, estimulação HOCl, prepare HOCl (200 μM) em HBSS (pré-aquecido a 37 ° C), imediatamente antes da adição às células. Certifique-se de que o HOCl não esteja preparado em meio celular completo.
nota: A concentração da solução-mãe de HOCl é quantificada medindo a absorvância UV da solução a 292 nm e pH = 116 e usando um coeficiente de extinção de 350 M-1 cm-1.
- Após o tratamento de polarização descrito na seção 2, aspire o meio celular de cada poço e lave cuidadosamente as células 3x com alíquotas de 1 mL de: PBS estéril (para PMA, TNFα e IL-8) ou HBSS (para HOCl), que foram pré-aquecidos a 37 ° C.
- Para experimentos com PMA, TNFα ou IL-8: adicione 1 mL do meio completo contendo PMA, TNFα ou IL-8 após remover o PBS na etapa final de lavagem.
- Para experimentos com TNFα, incubar as células por 6 h a 37 ° C na presença de 5% de CO2 em uma incubadora de células. Para experimentos com PMA e IL-8, incubar as células por 24 h a 37 ° C na presença de 5% de CO2 em uma incubadora de células.
- Para experimentos com HOCl, adicione 1 mL de HOCl em HBSS após remover o HBSS na etapa final de lavagem. Em seguida, incubar as células durante 15 min a 37 °C na presença de CO2 a 5% numa incubadora de células.
- Aspire cuidadosamente o sobrenadante celular e lave as células 3x com alíquotas de 1 mL de HBSS, conforme descrito na etapa 2.3.
- Depois de remover o HBSS da etapa final de lavagem, adicione 1 mL de meio de cultura RPMI-1640 completo. Em seguida, incubar as células durante 24 h a 37 °C na presença de 5% de CO2 numa incubadora de células.
3. Visualização de MET em cultura de células vivas
- Prepare o corante verde SYTOX em HBSS a uma concentração de 40 μM.
- No final dos tratamentos descritos na seção 2 para induzir a liberação de MET, adicione diretamente 25 μL de 40 μM do corante a cada poço contendo HMDM.
- Incube as células à temperatura ambiente (RT) por 5 minutos no escuro.
- Coloque o HMDM em poços de cultura de tecidos no estágio de microscópio de um microscópio fluorescente invertido para geração de imagens.
- Procedimentos de microscópio
- Ligue uma fonte de luz fluorescente de amplo espectro, uma fonte de luz de campo claro e um microscópio invertido instalados com uma câmera digital colorida de alta resolução (consulte a Tabela de materiais).
- Gire a roda do filtro para a posição "número 2" para fluorescência verde (excitação = 504 nm, emissão = 523 nm) para imagens das amostras coradas de verde contidas nos poços de cultura de tecidos.
- Usando a objetiva de 5x, foque a imagem com o foco grosso e, em seguida, os botões de foco fino no microscópio, até que a imagem pareça nítida, clara e focada quando vista através da ocular do microscópio.
- Mude o microscópio para o modo de câmera.
- Inicie o software associado.
- Selecione a guia Capturar no software.
- Clique no botão Reproduzir para visualizar a imagem e ajuste o botão de foco fino no microscópio até que a imagem apareça nítida, clara e focada na janela de visualização do software.
- Clique no botão Capturar.
nota: A imagem capturada será exibida automaticamente no software que o acompanha.
- No software, clique em Arquivo | Salve como o tipo de arquivo de imagem necessário.
- No microscópio, gire a roda do filtro para a posição "número 5" para imagens de campo claro e repita as etapas 3.5.2 a 3.5.9 para obter a imagem de campo claro correspondente.
- Repita as etapas 3.5.2 a 3.5.10 conforme necessário para a aquisição subsequente da imagem.