Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Purificação de leucócitos polimorfonucleares humanos e isolamento de soro humano
NOTA: Todos os reagentes devem ser verificados rotineiramente quanto à presença de endotoxina usando um kit de detecção de endotoxina disponível comercialmente e devem conter endotoxina de <25,0 pg/mL para evitar o priming indesejado de PMNs.
- Leve 50 mL de NaCl a 3% de dextrana a 0,9% (p / v), 35 mL de NaCl a 0,9% (p / v), 20 mL de NaCl a 1,8% (p / v), 12 mL de solução de gradiente de densidade de 1,077 g / mL e 20 mL de água para injeção ou irrigação à temperatura ambiente.
- Para isolar o soro humano, incubar 4 ml de sangue humano acabado de colher sem anticoagulante a 37 °C num tubo de vidro de 15 ml durante 30 min. Após a incubação, centrifugue a amostra a 2.000–3.000 × g por 10 min em temperatura ambiente. Transfira a camada superior de soro para um novo tubo de centrífuga cônico de 15 mL e coloque-o no gelo.
- Combine 25 mL de sangue humano total heparinizado recém-coletado (1000 unidades / mL) com 25 mL de temperatura ambiente 3% dextrano-0,9% NaCl (proporção 1: 1) em dois tubos de centrífuga cônicos replicados de 50 mL (50 mL de volume total por tubo). Misture agitando suavemente cada tubo cônico de 50 mL e deixe descansar em temperatura ambiente por 30 min.
- Após a incubação à temperatura ambiente, duas camadas separadas aparecerão. Transfira a camada superior de cada mistura de sangue dextrana para novos tubos cônicos de 50 mL e centrifugue a 450 x g por 10 min em temperatura ambiente com freios baixos ou sem freios.
- Aspirar cuidadosamente ambos os sobrenadantes e eliminá-los sem perturbar os grânulos celulares. Ressuspenda suavemente cada pellet celular em 2 mL de NaCl a 0,9% à temperatura ambiente, combine os pellets ressuspensos em um único tubo cônico de 50 mL e, em seguida, adicione o NaCl 0,9% restante (volume final de 35 mL).
- Aplique cuidadosamente 10 mL de solução de gradiente de densidade de 1,077 g/mL em temperatura ambiente sob a suspensão celular usando uma pipeta manual. Gire a 450 x g por 30 min em temperatura ambiente com freios baixos ou sem freios. Aspire suavemente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. O sobrenadante conterá células mononucleares do sangue periférico que podem ser coletadas conforme descrito anteriormente.
- Lise os glóbulos vermelhos ressuspendendo o pellet celular em 20 mL de água em temperatura ambiente. Misture delicadamente balançando o tubo por 30 segundos. A lise dos glóbulos vermelhos será acompanhada por uma diminuição distinta da turbidez.
- Adicione imediatamente 20 mL de NaCl a 1,8% (à temperatura ambiente [RT]) e centrifugue a amostra a 450 × g por 10 min à temperatura ambiente.
nota: É importante minimizar o tempo que os PMNs são deixados apenas na água após a lise dos glóbulos vermelhos para maximizar o rendimento do PMN e prevenir a lise e/ou ativação do PMN.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Ressuspenda suavemente o pellet celular em 2 mL de meio RT RPMI 1640 e coloque-o no gelo.
- Conte as células usando um hemocitômetro. Ressuspenda PMNs purificados a uma concentração de 1 x 107 células / mL com RPMI gelado e mantenha-os no gelo.
- Combine 100 μL de PMNs purificados (1 x 106 células) com 300 μL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco gelada (DPBS) contendo 1 μL de coloração de iodeto de propídio em dois tubos de citometria de fluxo replicados. Para um controle positivo de danos à membrana plasmática, adicione 40 μL de solução de Triton X-100 a 0,5% em um dos tubos de citometria de fluxo e misture bem.
- Use citometria de fluxo para medir a dispersão direta, dispersão lateral e coloração de iodeto de propídio (máximos de excitação / emissão a 535/617 nm) de células purificadas (Figura 1).
nota: A análise de dispersão direta e lateral identificará populações indesejadas de linfócitos e monócitos. O iodeto de propídio corará apenas as células com uma membrana plasmática comprometida e os PMNs purificados que tenham populações pronunciadas de células positivas para iodeto de propídio não devem ser usados. Para esses estudos, os PMNs purificados foram usados apenas se compreendessem >98% das células purificadas e <5% coraram positivo para iodeto de propídio.
- Prepare uma placa de 96 poços para ensaios de citotoxicidade de PMN revestindo poços individuais que serão usados neste ensaio com 100 μL de soro humano isolado a 20% que foi diluído com DPBS.
nota: O revestimento de PMNs diretamente em plástico ou vidro causará a ativação das células. Certifique-se de incluir pelo menos um poço de controle negativo que receberá apenas mídia e pelo menos um poço de controle positivo que receberá 0,05% de Triton X-100.
- Incubar a placa a 37 °C durante 30 min. Após a incubação, lave os poços revestidos duas vezes com DPBS gelada para remover qualquer excesso de soro. Bata suavemente na placa de cabeça para baixo para remover qualquer DPBS residual e coloque-a no gelo.
- Adicione suavemente 100 μL de PMNs humanos purificados a 1 x 107 células/mL a cada poço revestido (1 x 106 PMNs/poço). Deixe os PMNs se acomodarem em poços incubando a placa no gelo por pelo menos 5 min. Mantenha a placa nivelada para permitir a distribuição uniforme das células em cada poço e deixe-a no gelo para evitar a ativação indesejada de PMNs.
2. Ensaio de citotoxicidade de proteínas extracelulares de S. aureus contra leucócitos polimorfonucleares humanos
- Cultivar S. aureus durante a noite em caldo tríptico de soja (TSB) usando uma incubadora agitada ajustada a 37 °C. Para esses estudos, 20 mL de TSB em frascos Erlenmeyer separados de 150 mL foram inoculados com culturas congeladas de cepas de S. aureus USA300 ou USA300ΔsaeR/S e cultivadas por aproximadamente 14 h com agitação a 250 rpm.
- Subcultura de S. aureus realizando uma diluição de 1:100 de cultura bacteriana durante a noite com meio fresco. Incubar a 37 °C com agitação até que as bactérias atinjam a fase inicial de crescimento estacionário.
nota: Para esses experimentos, 20 mL de caldo tríptico de soja em frascos Erlenmeyer de 150 mL foram inoculados com 200 μL de USA300 ou USA300ΔsaeR/S cultivados durante a noite e incubados a 37 °C com agitação a 250 rpm por 5 h.
- Quando as bactérias atingirem a fase inicial de crescimento estacionário, transfira 1 mL de S. aureus subcultivado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 5.000 × g por 5 min em temperatura ambiente.
- Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para uma seringa de 3 ml. Passe os sobrenadantes por um filtro de 0,22 μm e para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL no gelo.
- Realizar diluições seriadas de sobrenadantes com meios gelados usados para cultivar S. aureus.
nota: Para os experimentos mostrados, os sobrenadantes de USA300 e USA300ΔsaeR/S foram submetidos a quatro diluições consecutivas de 1/2 log com TSB gelado.
- Adicione suavemente amostras ou meios sobrenadantes sozinhos (para controles negativos e positivos) a poços individuais de placas de 96 poços contendo PMNs em gelo a partir da etapa 1.15. Para esses experimentos, 10 μL de amostras sobrenadantes USA300 ou USA300ΔsaeR/S foram adicionadas a cada poço. Agitar suavemente a placa para distribuir os sobrenadantes nos alvéolos e incubar a 37 °C.
- Nos momentos desejados, retire a placa da incubadora e coloque-a no gelo. Adicione 40 μL de Triton X-100 a 0,5% ao poço de controle positivo.
- Pipetar suavemente as amostras para cima e para baixo em cada poço para retirar completamente todos os PMNs aderidos à placa e, em seguida, transferir as amostras para tubos de citometria de fluxo no gelo que contenham 300 μL de DPBS gelada com 1 μL de iodeto de propídio.
- Medir a proporção de PMNs positivos para iodeto de propídio por citometria de fluxo (figura 2A). Quando ligado ao DNA, o iodeto de propídio tem excitação/emissão a 535/617 nm.
