Ensaio de citotoxicidade de cepas de Staphylococcus aureus em neutrófilos após fagocitose

Neste artigo

Resumo

Fonte: Dankoff, J. G. et al., Quantificando a citotoxicidade de Staphylococcus aureus contra leucócitos polimorfonucleares humanos. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, demonstramos um ensaio para detectar a citotoxicidade de cepas virulentas e menos virulentas de Staphylococcus aureus contra neutrófilos humanos após fagocitose usando citometria de fluxo.

Protocolo

1. Ensaio de citotoxicidade de S. aureus contra leucócitos polimorfonucleares humanos após fagocitose

NOTA: As curvas de crescimento definidas pela densidade óptica a 600 nm (OD600) e pela concentração de bactérias devem ser determinadas empiricamente para as estirpes de S. aureus a ensaiar antes de se iniciar este ensaio. O sucesso desses experimentos requer a colheita consistente de concentrações iguais de cada cepa de S. aureus testada na fase de crescimento exponencial médio usando o OD600 de bactérias subcultivadas.

Inicie culturas noturnas de cepas de S. aureus e bactérias de subcultura conforme descrito abaixo.
1. Cultivar S. aureus durante a noite em caldo tríptico de soja (TSB) usando uma incubadora agitada ajustada a 37 °C. Para esses estudos, 20 mL de TSB em frascos Erlenmeyer separados de 150 mL foram inoculados com culturas congeladas de cepas de S. aureus USA300 ou USA300ΔsaeR/S e cultivados por aproximadamente 14 h com agitação a 250 rpm.
2. Subcultura de S. aureus realizando uma diluição de 1:100 de cultura bacteriana durante a noite com meio fresco. Incubar a 37 °C com agitação.
Colha S. aureus subcultivado quando ele atingir o crescimento exponencial médio, transferindo 1 mL de bactérias cultivadas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugando a 5.000 × g por 5 min em temperatura ambiente.
nota: Em nossas condições de crescimento, USA300 e USA300ΔsaeR/S atingiram a fase de crescimento exponencial médio após aproximadamente 135 min de incubação.
Lave S. aureus após a centrifugação aspirando o sobrenadante, ressuspendendo as bactérias peletizadas em 1 mL de DPBS, vortexando a amostra por 30 s e centrifugando a 5.000 × g por 5 min em temperatura ambiente.
Opsonize S. aureus ressuspendendo o pellet bacteriano em 1 mL de soro humano a 20% diluído com DPBS e incubando a 37 ° C com agitação por 15 min.
Centrifugue bactérias opsonizadas a 5.000 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Lave o S. aureus após a centrifugação, aspirando o sobrenadante, ressuspendendo a bactéria peletizada em 1 mL de DPBS e, em seguida, fazendo vórtice da amostra até que o pellet bacteriano esteja completamente quebrado por mais 30 segundos. Centrifugue bactérias a 5.000 × g por 5 min em temperatura ambiente.
Ressuspenda as cepas opsonizadas de S. aureus em 1 mL de RPMI, vortex a amostra até que o pellet bacteriano esteja completamente quebrado e, em seguida, por mais 30 s. Coloque as bactérias no gelo.
Dilua as cepas opsonizadas de S. aureus até a concentração desejada com RPMI gelado. Vórtice por 30 s e coloque no gelo.
Confirmar a concentração de S. aureus opsonizado por meio de plaqueamentos de diluições seriadas de bactérias 1:10 em ágar tríptico de soja.
nota: Como as diferenças na concentração de bactérias usadas neste ensaio podem ter um grande impacto na permeabilidade subsequente da membrana plasmática do PMN (Figura 1A), é essencial que a concentração de cada cepa testada seja determinada para cada experimento e seja equivalente entre as cepas.
Adicione suavemente 100 μL / poço de cada cepa de S. aureus ou RPMI (para controles positivos e negativos) aos PMNs na placa de 96 poços no gelo. Agite suavemente a placa para distribuir S. aureus em poços.
Sincronizar a fagocitose centrifugando a placa a 500 × g durante 8 min a 4 °C. Incubar a placa a 37 °C imediatamente após a centrifugação (T = 0).
Nos momentos desejados, retire a placa da incubadora e coloque-a no gelo. Adicione 40 μL de Triton X-100 a 0,5% ao poço de controle positivo.
Pipetar suavemente as amostras para cima e para baixo em cada alvéolo para retirar completamente todos os PMNs aderidos à placa e, em seguida, transferir as amostras para tubos de citometria de fluxo em gelo contendo 200 μL de DPBS gelada com 1 μL de iodeto de propídio.
Analise amostras para coloração de iodeto de propídio usando citometria de fluxo.
Meça a proporção de PMNs positivos para iodeto de propídio usando citometria de fluxo. Quando ligado ao DNA, o iodeto de propídio tem excitação/emissão a 535/617 nm.

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Resultados

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Figura 1: Análise por citometria de fluxo de PMNs após fagocitose de S. aureus. (A) A proporção de PMNs positivos para iodeto de propídio 90 min após a fagocitose de diferentes concentrações de USA300 ou USA300∆saeR / S. (B) A concentração de cepas opsonizadas de S. aureus usadas para os experimentos é mostrada no painel A. Os dados são apresentados como méd...