Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Estirpes e condições de cultura
Nota: A cepa de M. tuberculosis CDC1551 é usada neste estudo, mas qualquer cepa de M. tuberculosis pode ser usada da mesma maneira.
- Cultive as bactérias em M-OADC-TW (caldo 7H9 suplementado com 0,5% de glicerol, 10% de complexo de dextrose de ácido oleico sem catalase e 0,05% de Tween-80) em meio a 37 ° C a um OD600 de 0,5 (~ 0,2 x 107 unidade formadora de colônias ou UFC).
- Diluir a cultura em M-OADC-TW (série de diluições 1:10 da bactéria). Colocar em placas as diluições das bactérias (105, 106, 107, 108) em triplicado em placas selectivas de 7H11 para permitir a determinação do UFC.
- Incubar as placas durante quatro semanas a 37 °C ou até que as colónias possam ser contadas com precisão.
- Centrifugue o inóculo bacteriano a 8.534 x g por 5 min para obter um pellet. Lave o pellet uma vez com 10 mL de solução salina (NaCl 0,9%) e ressuspenda o pellet em 15 mL de solução salina (NaCl 0,9%).
2. Infecção por aerossol de camundongos usando uma câmara de Madison
- Permita que os ratos se acostumem com o novo ambiente por uma semana.
- Pese os ratos antes de carregá-los na câmara.
- Conecte três cabos no filtro de linha: a alimentação da câmara principal, a bomba de vácuo e o compressor de ar, nessa ordem.
- Desaparafuse cuidadosamente o frasco de vidro. Traga o frasco de vidro para o gabinete de biossegurança e adicione o inóculo de desafio suspenso em 15 mL de solução salina (0,9% NaCl) para atingir ~ 104 - 10 6 UFC de bactérias nos pulmões.
- Feche a tampa do frasco de vidro no armário de biossegurança. Conecte o frasco à unidade nebulizadora e ajuste o tubo vertical de aço inoxidável de modo que a extremidade inferior (entrada) fique cerca de um quarto de polegada abaixo do nível do fluido no frasco.
- Carregue todos os animais necessários para o experimento (a câmara pode conter até 90 ratos) na câmara e feche todas as travas da porta.
- Verifique o medidor de fluxo de ar principal (ambiente). Certifique-se de que o centro da bóia (bola) corra cerca de 50 L/min, conforme medido na escala à esquerda.
- Pressione o botão Iniciar no painel de controle da câmara. Defina a taxa de fluxo de ar através do medidor de fluxo de ar do compressor (o medidor menor à esquerda) como 4 L/min na escala. Verifique visualmente se o inóculo de provocação está a ser nebulizado.
- Após 15 min, quando a luz vermelha na frente do painel de controle aparecer e um sinal sonoro indicar o fim da corrida, pressione o botão Reset no canto inferior direito do painel de controle para redefinir os cronômetros.
- Mantenha pressionado o pequeno botão vermelho na porta da câmara para liberar o vácuo.
- Abra a porta da câmara e remova os animais. Coloque os ratos de volta em suas gaiolas.
- Remova o frasco do nebulizador de vidro e coloque-o em um recipiente de transporte selado e à prova de vazamentos. Coloque o recipiente dentro do gabinete de biossegurança e descarte a suspensão de desafio em um recipiente de lixo designado.
- Coloque o frasco nebulizador usado dentro de um saco de risco biológico e feche o saco para transporte para a autoclave.
- No final do procedimento de infecção, borrife o interior da câmara com fenol tamponado e etanol a 70% e deixe a câmara descansar por 10 min.
- Em seguida, limpe todas as superfícies internas acessíveis com muito cuidado. Descarte todas as toalhas de papel contaminadas, etc. no lixo de risco biológico. Autoclave o lixo, recipientes de lixo e frascos nebulizadores usados.
- Colocar os animais de volta na sala de contenção até ao momento da imagiologia.
- No dia da imagem, transfira os animais em um recipiente secundário para a sala de imagem.
3. Anestesia animal
- Anestesiar os camundongos com isoflurano usando um sistema de anestesia a gás personalizado.
- Pese cada um dos dois recipientes de filtro de carvão localizados na parte superior da unidade de anestesia.
- Substitua por um novo recipiente se o peso for 50 g acima do peso inicial.
- Verifique a unidade vaporizadora para garantir isoflurano suficiente para o procedimento.
- Coloque o suporte do cone do nariz dentro da câmara de imagem. Coloque o número de cones nasais necessários para o procedimento e sele as aberturas restantes com os bloqueadores de cones nasais.
- Ligue o suprimento de oxigênio do cilindro de alta pressão e ajuste-o para 55 psi.
- Ligue a bomba de evacuação localizada na frente da unidade de anestesia e ajuste-a para 8 L/min.
- Ligue o botão de oxigênio localizado na frente da unidade de anestesia.
- Ligue o fluxo de gás para a câmara de indução de anestesia para definir o fluxo de gás em 1.5 L/min. Desligue o fluxo de gás.
- Ligue o fluxo de gás para a câmara de imagem para definir o fluxo de gás em 0.25 L/min. Desligue o fluxo de gás.
- Ligue o vaporizador de isoflurano e ajuste-o para 2 - 2,5%. Ajuste o nível de isoflurano de acordo com o número e peso dos animais usados para o experimento, girando o botão do vaporizador de isoflurano (2 - 2,5% para um camundongo pesando ~ 20 g; 4% para uma cobaia pesando 300 g).
- Coloque os camundongos na câmara de anestesia e feche a tampa. Ligue o fluxo de gás para a câmara de indução de anestesia.
- Deixe os camundongos na câmara de indução de anestesia por 5 a 10 minutos até que estejam completamente anestesiados.
- Depois que os camundongos estiverem anestesiados, aplique uma pomada óptica nos olhos para protegê-los durante a imagem.
- Coloque os camundongos em decúbito ventral ou esternal de modo que seus narizes sejam colocados no cone do nariz para facilitar a anestesia dos camundongos durante o procedimento de imagem.
4. Imagem de fluorescência enzimática repórter (REF)
- Injete o substrato (20 μM, 2,5 μL / g de peso) por injeção intraperitoneal nos camundongos infectados e no controle. Os camundongos ficam sob anestesia dentro da câmara de imagem por menos de 1 minuto.
- Inicie o sistema de imagem.
- Inicialize o sistema clicando em Inicializar. Aguarde até que a barra de temperatura fique verde.
nota: A câmara de imagem consiste em uma plataforma aquecida para manter a temperatura corporal do animal durante a imagem.
- Para a configuração de aquisição de imagens, selecione Fluorescente | Trans-iluminação para animais inteiros ou Epi-iluminação para tecidos pulmonares, Estrutura e Sobreposição no Painel de Controle de Aquisição.
- Defina o Campo de visão como B para um único mouse e o nível da lâmpada como alto.
- Defina o tempo de exposição para automático, binning médio, 2 - 3 para f/stop e filtro de excitação em 745 nm e filtros de emissão de 780 nm a 840 nm.
- Para configuração de sequência, clique em Configuração de sequência e selecione 9 - 12 pontos de transiluminação na área pulmonar.
- Clique em Adquirir para aquisição de imagem.
- Coloque o mouse de volta na gaiola após a geração de imagens.
- Monitore os camundongos até que estejam totalmente recuperados ou sacrifique-os para quantificar a UFC se a imagem for em um ponto de tempo do experimento. Realize uma pontuação de Karnofsky modificada para monitorar o bem-estar de camundongos após a imagem.
