Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Isolamento e diferenciação de macrófagos derivados da medula óssea (BMMs)
- Dia 0: Sacrifique 4 - camundongo fêmea C57BL/6 ou BALB/c de 6 semanas em uma câmara de CO2 e confirme a morte por luxação cervical. Garanta a esterilização de tesouras e pinças, mantendo-as embebidas em etanol a 70%. Pulverize luvas com etanol a 70% para permitir o manuseio estéril durante todo o processo de isolamento das células da medula óssea.
- Prenda o camundongo sacrificado à placa de dissecação prendendo seus membros anteriores e desinfetando-o borrifando abundantemente com etanol 70%.
- Faça uma pequena incisão (cerca de 1 cm) com uma tesoura perto da articulação do quadril. Insira cuidadosamente uma tesoura sob a pele para separar o músculo subjacente e cortar a pele ao redor da articulação do quadril.
nota: A placa de dissecção pode ser girada para permitir melhor acesso à articulação do quadril.
- Desenluve cuidadosamente a pele da perna, puxando em direção ao tornozelo e removendo-a. Corte o pé no tornozelo, tomando muito cuidado para cortar na articulação do tornozelo ou abaixo dela para deixar a tíbia totalmente intacta.
nota: A fíbula nesta fase está frouxamente presa e pode ser facilmente separada com a pinça.
- Localize manualmente a articulação do quadril manipulando o fêmur para identificar o ponto de rotação. Use uma tesoura com cuidado para cortar a perna acima da articulação do quadril para deixar a cabeça proximal do fêmur intacta.
- Remova o máximo possível de músculo e tecido conjuntivo da perna com uma tesoura. Remova qualquer pele restante do tornozelo e qualquer excesso de material ósseo acima da articulação do quadril.
- Coloque os ossos da perna limpos em RPMI estéril do Roswell Park Memorial Institute suplementado com penicilina/estreptomicina (concentração final de 1%) em uma placa de Petri no gelo.
- Repita as etapas 1.4 a 1.6 para isolar a tíbia e o fêmur da outra perna traseira.
- Remova qualquer músculo e tecido conjuntivo remanescente dos ossos embebidos em RPMI usando uma pinça esterilizada e lâmina estéril # 10.
- Coloque os ossos na tampa da placa de Petri. Corte a tíbia cuidadosamente com a lâmina imediatamente acima da articulação do tornozelo para acessar a medula. Remova a tíbia do resto da perna cortando imediatamente abaixo da articulação do joelho.
- Retire 10 mL de RPMI estéril suplementado com penicilina/estreptomicina (concentração final de 1%) em uma seringa de 10 mL e coloque uma agulha de 25G.
- Segure a tíbia firmemente com uma pinça, verticalmente sobre um tubo cônico de 50 mL no gelo. Use a seringa para injetar suavemente aproximadamente 5 mL de RPMI na extremidade do osso para liberar a medula óssea da outra extremidade para o tubo cônico. Lave a medula óssea com um total de 10 mL de RPMI até que o osso fique branco.
nota: Após uma lavagem completa, o osso deve ficar branco. Caso contrário, continue lavando para remover a medula. A extremidade distal da tíbia pode precisar ser aparada com a lâmina se for muito estreita para inserir a agulha.
- Corte o fêmur imediatamente acima da articulação do joelho e imediatamente abaixo da articulação do quadril para expor ambas as extremidades do osso para acessar a medula. Lavar a medula óssea do fêmur com um total de 10 mL de RPMI da mesma forma que a tíbia.
- Repita as etapas de limpeza e lavagem 1.6 a 1.13 com os ossos restantes e colete as células lavadas da medula óssea em um único tubo cônico de 50 mL
nota: Se um osso quebrar em qualquer ponto durante a dissecção antes da lavagem óssea, não use a medula desse osso.
- Centrifugue o tubo cónico utilizado para recolher a medula óssea lavada dos quatro ossos durante 10 minutos a 4 °C a 300 x g.
- Colocar 60 ml de meio BMM estéril (RPMI com uma concentração final de 20% de soro fetal bovino, FBS, penicilina/estreptomicina a 1%, 1,2 mM de Na-piruvato, 25 μg/ml de fator estimulador de colónias de macrófagos humanos (M-CSF) num balão de cultura de2 células de 175 cm com tampa de filtro.
- Rejeitar o sobrenadante após centrifugação e ressuspender o sedimento celular por pipetagem suave para cima e para baixo utilizando 5 ml de meio BMM do balão.
- Transferir a suspensão celular para o balão de cultura e enxaguar o tubo cónico duas vezes com meio BMM do balão de cultura para assegurar a máxima recuperação celular. Certifique-se de que a suspensão celular esteja completamente misturada em um meio e distribua 30 mL do frasco inicial de175 cm de 2 células para um segundo frasco de 175 cmde 2 células com uma tampa de filtro.
- Incubar ambos os frascos contendo 30 mL de suspensão celular durante a noite a 37 ° C, 5% de dióxido de carbono (CO2) para permitir a separação de quaisquer fibroblastos contaminantes, macrófagos residentes e outras células aderentes.
- DIA 1: Transfira o sobrenadante contendo células indiferenciadas da medula óssea dos frascos para placas de Petri de poliestireno não tratadas com TC de 100 mm x 15 mm a aproximadamente 10 mL / placa e incube a 37 ° C, 5% CO2.Descarte os frascos.
- DIA 3 ou 4: Adicione mais 5 mL de meio BMM (pré-aquecido a 37 °C) a cada placa de Petri e continue a incubação a 37 °C, 5% de CO2.
2. Plaqueamento de BMMs em lamínulas para infecção (DIA 7 ou 8)
- Prepare placas de cultura de tecidos de 6 poços colocando quatro (4) lamínulas de vidro estéreis de 12 mm (autoclavadas e armazenadas em um recipiente de vidro fechado) no fundo de cada poço vazio.
nota: Pegue cada lamínula estéril de 12 mm com uma ponta de aspiração encaixada em uma linha de vácuo. Coloque as lamínulas nos poços sem sobreposição, soltando-as na posição desejada apertando o tubo para interromper o vácuo.
- Aspire o meio (e quaisquer células não aderentes) de placas de Petri revestidas com macrófagos derivados da medula óssea aderentes e enxágue suavemente as células aderentes 2x com solução salina estéril tamponada com fosfato de Dulbecco sem cloreto de cálcio e magnésio (PBS -/-) pré-aquecido a 37 ° C.
- Adicione gota a gota, 5 mL de PBS 1x estéril -/- com uma concentração final de 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a cada placa de Petri e incube por 5 min a 37 ° C para separar os BMMs aderentes. Verifique se as células estão destacadas usando um microscópio.
- Colete todas as células destacadas suspensas em 1x PBS -/- suplementado com 1 mM de EDTA em um tubo cônico de 50 mL. Enxágue cada prato 2x com 5 mL de PBS -/- e adicione à piscina de suspensão de células.
nota: A suspensão celular pode ser diluída com PBS adicional -/- para proteger os macrófagos da toxicidade do EDTA durante o processo de colheita.
- Centrifugue a 300 x g por 10 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os macrófagos em meio BMM de 5 a 10 mL por pipetagem. Coloque as células ressuspensas no gelo para evitar a fixação em tubos e aglomeração.
- Contagem de células viáveis usando exclusão de azul de tripano no hemocitômetro.
nota: Para contar as células BMM ressuspensas em meio de 5 mL, uma mistura de diluição de 25 μL de suspensão de células em 445 μL de PBS -/- e 30 μL de solução de azul de tripano a 0,4% normalmente permite uma fácil quantificação em um hemocitômetro (levando em consideração um fator de diluição de 20x para o cálculo final). Conte apenas as células que não foram coradas com azul de tripano (células viáveis). O volume da suspensão celular pode ser alterado se esta mistura estiver demasiado concentrada ou diluída. Em geral, o rendimento de BMM por preparação varia entre 2 x 107 e 5 x 107 células de um único camundongo.
- Preparar a suspensão celular em meio BMM na concentração de plaqueamento desejada (5 x 105/mL) e dispersar a suspensão em placas de 6 poços em 2 mL de meio por poço, de modo que cada poço receba 1 x 106 macrófagos.
nota: Esta é uma etapa crítica que garante que cada poço receba um número adequado de macrófagos para cobrir as lamínulas uniformemente. Verifique se as lamínulas nos poços não estão sobrepostas ou flutuando no meio. Nesse caso, ajuste suavemente com uma ponta de pipeta estéril.
- Incubar durante a noite a 37 °C, 5% CO2.
3. Purificação de Formas Infecciosas de Leishmania amazonensis
NOTA: Prepare Leishmania para infecções - purifique promastigotas metacíclicos de culturas promastigotas estacionárias ou diferencie promastigotas em cultura na forma amastigota usando o protocolo padrão de diferenciação axênica de L. amazonensis.
- Purificação de promastigotas metacíclicos de Leishmania usando meios de gradiente de densidade (Materiais)
- Prepare a solução estoque a 40% de meio de gradiente de densidade em água estéril e livre de endotoxinas.
- Diluir a solução de gradiente de densidade em meio M199 10x (sem soro) para preparar a concentração de 10% no meio M199.
- Filtre todas as soluções através de um filtro de 0,22 μm.
nota: As soluções de estoque podem ser armazenadas a 4 oC na escuridão por no máximo 1 mês.
- Adicione 2 mL de solução de mídia de gradiente de densidade a 40% no fundo de um tubo de centrífuga cônico de 15 mL.
- Camada 2 mL de solução de mídia gradiente de densidade de 10% em M199 sobre a camada de mídia gradiente de densidade de 40% com cuidado, usando uma pipeta Pasteur para evitar qualquer mistura entre as duas camadas.
- Colete 1 x 109 parasitas da cultura em fase estacionária por centrifugação a 1.900 x g por 10 min.
- Ressuspenda as células em 6 mL de meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM).
- Camada 2 mL da suspensão celular diretamente sobre a camada de mídia de gradiente de densidade de 10%, suavemente, usando uma pipeta Pasteur para evitar a mistura entre as camadas.
- Centrifugue o gradiente por 10 min a 1.300 x g em temperatura ambiente.
nota: Devido às diferenças nas propriedades físicas entre as espécies de Leishmania, as condições de centrifugação para cada uma podem ter que ser ligeiramente ajustadas para garantir o rendimento máximo.
- Coletar parasitas (enriquecidos na forma promastigota metacíclica) da banda formada no limite superior do meio de gradiente de densidade de 10% (interface entre as camadas de meio de gradiente de densidade de 0% e 10%).
- Diluir os parasitas com um volume de DMEM e coletá-los por centrifugação (1.900 x g durante 10 min à temperatura ambiente).
- Ressuspender em meio DMEM de 500 μL e contar em um hemocitômetro para quantificar o rendimento.
- Geração de amastigotas de L. amazonensis em condições de cultivo axênico (baixo pH / temperatura elevada)
- Misture 5 mL de cultura promastigota em fase logarítmica (pH 7,4 a 26 oC) com um volume igual de meio amastigota (pH 4,5), usando frascos de 25 cm2 (total de 10 mL de meio) e incube a 26 ° C durante a noite.
- Deslocar o balão de 26 °C para 32 °C.
- Após 3 ou 4 dias, dividir a cultura 1:5 em meio amastigota a 32 °C.
- Verifique os parasitas nos próximos 3 a 4 dias (máximo de 7 dias) para ver se eles estão prontos para uso em infecções.
nota: As amastigotas axênicas saudáveis devem ter formato oval, sem flagelos visíveis. As amastigotas parcialmente diferenciadas têm uma grande forma oval com flagelos curtos. A cultura não deve ter muitos aglomerados - muitos aglomerados são uma indicação de parasitas que não crescem e estão morrendo. A cultura amastigota pode ser dividida 1:5 e mantida por no máximo 3 semanas.
4. Infecção por L. amazonensis
- Dilua as suspensões de parasitas de acordo com a multiplicidade desejada de infecção (MOI) (geralmente 3-5 promastigotas metacíclicos por macrófago [MOI de 1:3 ou 1:5] e 1 amastigota por macrófago [MOI 1:1]). Adicione Leishmania em PBS -/- em um volume de 50 - 100 μL a cada poço que já contém 2 mL de meio.
- Incubar BMMs por 1 h com amastigotas e 3 h com promastigotas metacíclicos a 34 oC para infecção.
nota: A temperatura ideal de infecção pode variar de acordo com a espécie.
- Após a incubação, lave completamente os parasitas livres em cada poço 3x com 2 mL de PBS -/- pré-aquecido a 37 °C.
nota: Disperse o PBS suavemente para garantir que as lamínulas não flutuem umas sobre as outras. Gire suavemente a placa e aspire o líquido. Use uma ponta de aspiração separada se estiver usando várias cepas de parasitas para evitar contaminação cruzada.
- Fixe amostras de ponto de tempo de 1 h ou 3 h incubando cada poço com 1,5 - 2 mL de PFA a 2% em PBS -/- por 10 min. Lave 3x com PBS -/-. Não aspire as placas de última lavagem e refrigere as placas contendo lamínulas em PBS até a coloração.
- Adicionar 2 ml de meio BMM fresco a cada alvéolo nas placas para obter mais pontos de tempo e incubar a 34 °C.
- Corrija os pontos de tempo restantes conforme desejado, conforme descrito na etapa 4.3, e leve à geladeira as placas até a coloração.
5. 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) Coloração e montagem de lamínula
- Aspire PBS de poços contendo lamínulas e adicione 1,5 mL de PBS -/- com 0,1% de detergente não iônico. Incubar por 10 min em temperatura ambiente, seguido de 3x lavagem com 2 mL de PBS -/-.
- Adicionar 1 mL de PBS -/- com 2 μg/mL de DAPI (diluído a partir de 5 mg/mL de solução-mãe em água) aos poços contendo lamínulas e incubar por mais 1 h à temperatura ambiente.
nota: O tempo de incubação com DAPI é fundamental para a visualização adequada de parasitas de Leishmania intracelulares. Os núcleos dos macrófagos coram rapidamente, devido ao seu tamanho maior e conteúdo de ácido desoxirribonucléico (DNA), mas a coloração dos núcleos dos parasitas intracelulares é mais lenta. Assim, estender o tempo de incubação além do necessário para visualizar os núcleos do BMM é necessário para permitir que o DAPI permeie através da membrana plasmática do parasita e da membrana nuclear do parasita. Com a coloração DAPI adequada, o DNA do cinetoplasto mitocondrial próximo à bolsa flagelar do parasita também pode ser visualizado, além do DNA nuclear.
- Lave cada poço contendo lamínulas 3x com 2 mL de PBS -/- e, em seguida, levante e vire as lamínulas com uma pinça para colocar o lado da célula para baixo e monte em lâminas de microscópio de vidro com um reagente de montagem antidesbotamento disponível comercialmente.
nota: As lamínulas são extremamente frágeis e precisam de manuseio cauteloso. Evite pressioná-los, especialmente contra a parede lateral dos poços ao levantar. A adição de algumas gotas de PBS -/- reduz a tensão superficial entre a lamínula e o poço e facilita o processo de elevação. Uma agulha de calibre fino pode ser usada para ajudar a erguer as lamínulas do fundo do poço. Depois de colocar uma lamínula na lâmina, pressione suavemente com uma pinça para empurrar para fora quaisquer bolhas de ar na mídia de montagem. Se uma lamínula estiver quebrada ou possivelmente tiver virado durante o processo de elevação, não remonte; basta usar a quarta lamínula sobressalente.
- Refrigerar as lâminas até à quantificação.
6. Quantificação de infecção
- Examine as lâminas coradas com DAPI sob um microscópio de fluorescência, concentrando-se nos macrófagos usando uma lente objetiva de 100X com óleo de imersão (excitação a 358 nm; emissão ideal a 461 nm).
Certifique-se de que o foco esteja na camada de macrófagos entre a lâmina de vidro e a lamínula.
- Quantifique o número de macrófagos (núcleos grandes corados com DAPI) e o número de núcleos amastigotas menores agrupados em torno de cada núcleo de macrófago (ver Figura 1A, DAPI) para cada campo de visão, usando um contador manual.
nota: Os núcleos amastigotas podem não ser todos visíveis em um plano de foco devido ao seu pequeno tamanho. Conte aqueles que são visíveis quando focados nos núcleos dos macrófagos e, em seguida, use o foco fino para verificar se há núcleos do parasita nos planos acima e abaixo dos núcleos dos macrófagos.
- Vá para outro campo de visão para repetir a quantificação. Use uma chave de contador separada para rastrear o número de campos contados. Percorra os campos visuais em linhas paralelas em cada lamínula, para evitar a sobreposição de contagem.
- Quantificar um mínimo de 200 macrófagos por lamínula. Quantificar cada ponto temporal da infeção em triplicata (3 lamínulas). Conte a quarta lamínula se uma das anteriores não for adequada para contagem devido à sobreposição da lamínula, má montagem, quebra de vidro, etc.
nota: Se 200 macrófagos não puderem ser contados em nenhuma lamínula, conte o quarto sobressalente.
- Calcule as taxas de infecção como amastigotas/macrófagos ou amastigotas/100 macrófagos e determine a porcentagem de macrófagos infectados a partir dos dados brutos de quantificação.
