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1. Passagem de culturas organoides
- Adicione 1 ml de meio basal frio à matriz basal no poço. Usando uma micropipeta de 1 ml, pipete vigorosamente para cima e para baixo até que a matriz basal seja quebrada. Transferir para um tubo de 15 ml. Coloque no gelo.
- Pegue os organoides na pipeta e pipete vigorosamente 10x para cima e para baixo. A quebra dos organoides pode ser observada a olho nu.
2. Microinjeção de cultura organoide.
Nota: Este protocolo pode ser usado para microinjetar bactérias em organoides. Pode ser útil iniciar a injeção com organoides que são mais permissivos à microinjeção. Por exemplo, organoides gástricos de camundongos podem se transformar em organoides císticos muito grandes que são fáceis de atingir.
- Preparação do material
- Puxe um capilar de vidro em duas agulhas de injeção usando um extrator de micropipeta, de acordo com as recomendações dos fabricantes. O extrator de micropipeta aquecerá o capilar de vidro no meio e puxará o capilar em duas partes, gerando assim duas agulhas de vidro. É prático puxar várias agulhas e guardá-las em uma placa de Petri limpa.
- Para permitir a infecção bacteriana, remova os antibióticos de todos os meios por pelo menos 3 trocas de meio (= uma semana). Isso diluirá os antibióticos da matriz basal. Se estiver usando uma cepa bacteriana resistente a um antibiótico específico, adicione esse antibiótico específico para minimizar as chances de contaminação.
- Prepare a bancada para microinjeções. Para trabalhos em diferentes níveis de biossegurança, pode ser necessário colocar um estereomicroscópio dentro de uma bancada estéril. Neste protocolo, injetar H. pylori em condições de nível 2 de biossegurança sob um estereomicroscópio dentro de uma bancada estéril.
- Cultive as bactérias de acordo com os protocolos padrão.
- Para estimar a multiplicidade de infecção (MOI), estime dois parâmetros: o número de bactérias e o número de células por organoide, conforme descrito abaixo. O MOI pode se correlacionar com os resultados, por exemplo, com a expressão de mRNA de IL-8 do hospedeiro.
- Para calcular a densidade bacteriana na solução de infecção, primeiro estabeleça a curva padrão de densidade óptica e unidades formadoras de colônias (UFC) de acordo com os protocolos padrão. Uma densidade óptica de 0,1 a 550 nm deve produzir aproximadamente 107 UFC/ml.
- Para estimar o número de células por organoide, conte o número de organoides em 1 poço. Interrompa os organoides conforme descrito nas etapas 1.1-1.4. Após centrifugação durante 5 min a 200 x g e 4 °C, adicionar 1 ml de solução de dissociação enzimática e ressuspender.
- Incube a 37 ° C com agitação repetida por 5-10 min. Determine se as células se dissociaram em células únicas sob o microscópio (microscópio invertido, como Leica DMIL com ampliação de 10X). Se necessário, prolongue a incubação.
- Conte as células por organoide usando um hemocitômetro e calcule o número de células por organoide. Os organoides gástricos humanos com um diâmetro de cerca de 200 μm têm aproximadamente 4.000 células. A injeção de 0,2 μl de uma solução bacteriana com 1 x 109 bactérias por ml resulta em um MOI aproximado de 50.
- Injeção de Organoides.
Nota: Para microinjeção, a agulha de vidro é estabilizada em um suporte, que pode ser manobrado em 3 dimensões por um micromanipulador. Os organoides permanecem dentro da matriz do embasamento dentro do poço. Devido ao tamanho e posicionamento no poço, nem todos os organoides são igualmente passíveis de injeção. Normalmente, os 30 maiores organoides em um poço podem ser direcionados em 5 min.
- Colha as bactérias e lave-as no meio basal de acordo com os protocolos padrão.
- Calcular o número de bactérias por ml de acordo com a densidade óptica (ver passo 2.1.5.1). Diluir as bactérias para 1 x 109 bactérias por ml num meio basal.
- Pegue uma agulha de vidro. Usando uma pinça, quebre a ponta de modo que a abertura tenha aproximadamente 10 μm de largura.
- Insira a agulha no suporte de injeção e fixe-a no micromanipulador.
- Pegue aproximadamente 10 μl de solução bacteriana na agulha.
- Coloque uma placa de 4 poços com bordas baixas contendo culturas organoides sob o estereomicroscópio.
- Navegando com o micromanipulador, mire em um único organoide com a agulha. Posicione a agulha perto do organoide e, em seguida, insira a agulha no organoide com um movimento rápido. Injete aproximadamente 0,2 μl de solução bacteriana em cada organoide usando o microinjetor.
3. Colha organoides para qualquer análise.
- Por exemplo, fixe os organoides após 4 horas. Remova o sobrenadante e adicione 1 ml de formaldeído a 2% e incube 20 min em RT ou O/N a 4 °C. Os organoides podem ser processados para imuno-histoquímica de acordo com procedimentos padrão.