1. Geração de uma biblioteca de mutantes de proteína de fluorescência verde, Coxiella transposon marcados com GFP
Manipular Coxiella burnetii RSA439 NMII em um nível de contenção de biossegurança 2 (BSL-2) em um gabinete de segurança microbiana (MSC) em conformidade com as regras locais. Se for compatível com o modelo bacteriano utilizado, repetir os passos de 1.4.1 a 1.4.4 para aumentar a probabilidade de obtenção de mutantes clonais. Uma biblioteca mutante típica é composta (pelo menos) por um número de mutantes que é igual a três vezes o número de sequências codificantes anotadas no genoma do organismo usado.
- Preparação da eletrocompetente Coxiella RSA439 NMII:
- Prepare 1x citrato cisteína acidificado meio-2 (ACCM-2): 13,4 mM de ácido cítrico, 16,1 mM de citrato de sódio, 3,67 mM de fosfato de potássio, 1 mM de cloreto de magnésio, 0,02 mM de cloreto de cálcio, 0,01 mM de sulfato de ferro, 125,4 mM de cloreto de sódio, 1,5 mM de L-cisteína, 0,1 g/L de Bacto Neopeptona, 2,5 g/L de casaminoácidos, 1 g/L de metil beta-ciclodextrina, 125 ml/L do Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Ajuste o pH para 4,75 e filtre a esterilização (não autoclave).
nota: O ACCM-2 líquido é estável a 4 °C por aproximadamente 1 mês.
- Inocular 100 ml de ACCM-2 com 2 x 106 equivalentes genoma (GE)/ml de Coxiella RSA439 NMII (a partir de uma reserva bacteriana previamente gerada e quantificada como na etapa 1.5) a partir de existências de -80 °C e distribuir a suspensão bacteriana em frascos de 75 cm2 para cultura de células com tampas de ventilação (10 - 15 ml de suspensão bacteriana por balão). Crescer durante 7 dias a 37 °C numa atmosfera humidificada de 5% de dióxido de carbono (CO2) e 2,5% de oxigénio (O2).
- Agrupar a suspensão bacteriana resultante em tubos de 50 ml e centrifugar a 3.900 x g durante 1 hora a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 30 ml de glicerol a 10%. Centrifugue a 3.900 x g por 1 hora a 4 °C.
- Ressuspenda o pellet em um volume adequado de 10% de glicerol (normalmente 2 ml) e alíquota de 50 μl em tubos de 500 μl. Mantenha as bactérias ressuspensas no gelo durante todo o processo.
nota: Nesta fase, as bactérias são eletrocompetentes e uma alíquota é suficiente para realizar uma eletroporação. As suspensões bacterianas podem ser armazenadas a -80 °C por 6 meses ou ser usadas diretamente para eletroporação de ácido desoxirribonucléico (DNA) plasmídeo.
- Electroporação de Coxiella competente com plasmídeos codificadores de transposon e transposase:
- Pré-resfrie uma cubeta de eletroporação de 0,1 cm por 10 min em gelo. Misturar 50 μl de Coxiella eletrocompetente com 10 μg de plasmídeo de transposão e 10 μg de plasmídeo de transposase. Certifique-se de que a concentração de plasmídeo seja superior a 500 μg/ml para minimizar a diluição do glicerol.
- Eletroporar usando a seguinte configuração: 18 kV, 500 Ω, 25 μF. Certifique-se de que a constante de tempo resultante seja compreendida entre 9 e 13 mseg.
- Adicione imediatamente 950 μl de RPMI, ressuspenda as bactérias eletroporadas e transfira para um tubo com tampa de rosca e mantenha em temperatura ambiente.
- Pegue 200 μl da bactéria eletroporada e adicione 3 ml de ACCM-2 suplementado com 1% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) em placas de 6 poços. Adicionar 88 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) ao volume restante de bactérias eletroporadas (para atingir uma concentração final de 10% de DMSO) e armazenar a -80 °C.
NOTA: para o protocolo a seguir, o elemento transponível e a transposase são codificados por dois plasmídeos diferentes (pITR-CAT-GFP e pUC19-Himar1C9, respectivamente). Ambos os plasmídeos não possuem uma origem de replicação específica de Coxiella, tornando-os plasmídeos suicidas quando eletroporados em Coxiella. Isso garante inserções de transposon estáveis. O elemento transponível contém uma de resistência ao cloranfenicol sob a regulação do promotor p1169 da Coxiella para seleção e o gene gfp sob a regulação do promotor p311 da Coxiella para marcar os mutantes gerados com GFP.
- Seleção dos mutantes do transposão:
- Incubar as placas de 6 poços inoculadas conforme descrito acima (1.2.4) durante a noite a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 2,5% de O2. Adicionar os antibióticos adequados (375 μg/ml de canamicina ou 3 μg/ml de cloranfenicol). Incubar a cultura bacteriana durante mais 3 dias nas condições acima descritas.
- Isolamento de mutantes individuais:
- Preparação de placas sólidas de ACCM-2 e plaqueamento de mutantes de transposon de Coxiella
nota: As instruções a seguir são para 1 placa de Petri, várias diluições de culturas bacterianas devem ser testadas para avaliar o volume ideal de inoculação para isolamento de colônias.
- Aqueça 10,5 ml de agarose a 0,5% no micro-ondas e deixe esfriar em banho-maria a 55 °C. Aquecer 11,25 ml de 2x ACCM-2 (pH 4,75) a 37 °C.
- Prepare agarose inferior:
- Misture 10 ml de agarose a 0,5% derretida com 10 ml de 2x ACCM-2 e adicione os antibióticos apropriados (375 μg / ml de canamicina ou 3 μg / ml de cloranfenicol).
- Despeje imediatamente na placa de Petri. Mantenha a placa de Petri sem tampa, deixe o meio esfriar por 30 min e seque ao ar por 20 min.
- Prepare a agarose superior:
- Misturar 1,25 ml de 2x ACCM-2 com 0,75 ml de água num tubo de poliestireno de 5 ml, adicionar os antibióticos adequados (375 μg/ml de canamicina ou 3 μg/ml de cloranfenicol) e incubar a 37 °C.
- Adicione a cultura bacteriana (normalmente 1 a 100 μl) e vore por 5 segundos.
- Adicione 0,5 ml de agarose derretida, misture e despeje imediatamente sobre a agarose inferior.
- Deixe esfriar por 20 min, recoloque a tampa da placa de Petri e incube a 4 ° C por 20 min para facilitar a solidificação da agarose.
- Secar ao ar por 20 min sem tampa em um MSC. Cultive as placas a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 2,5% de O2 por 6 a 7 dias.
- Adicionar DMSO às culturas bacterianas restantes para atingir uma concentração final de 10% de DMSO e armazenar a -80 °C.
- Avaliar a diluição óptima do seguinte modo: assegurar que as colónias têm 0,5 a 1 mm de diâmetro e estão devidamente isoladas para evitar a contaminação cruzada. Descongelar as culturas bacterianas restantes do ponto 1.4.2 e emplacar na diluição adequada em ágar-ACCM-2, conforme descrito nos pontos 1.4.1.2 e 1.4.1.3. Incubar durante 6 a 7 dias, conforme descrito no ponto 1.4.1.3.5.
- Uma vez que as colônias sejam detectáveis, colete-as cortando a ponta de uma ponta de 1 ml, pegando o tampão contendo colônias isoladas e dispersando a colônia pipetando em 1,5 ml de ACCM-2 contendo os antibióticos apropriados (375 μg / ml de canamicina ou 3 μg / ml de cloranfenicol) em uma placa de 24 poços. Amplificar as colónias individuais durante 6 dias nas condições descritas no ponto 1.3.1. No dia 3 de incubação, disperse os aglomerados bacterianos pipetando cada cultura.
- Armazene cada suspensão mutante em tubos de tampa de rosca com código de barras 2D em placas de 96 poços em DMSO a 10% a -80 °C.
- Avaliação da concentração bacteriana:
nota: O protocolo a seguir pode ser aplicado para obter as curvas de crescimento de mutantes bacterianos que se replicam em meio axênico (ver 1.4.4).
- Preparação da curva padrão:
- Preparar uma solução-mãe de 2 μg/ml de ADN de fita dupla (dsADN) (normalmente um plasmídeo aleatório de tamanho e concentração conhecidos) em 1x ácido trisetilenodiaminotetracético, EDTA (TE). Preparar diluições seriadas de 10 vezes a partir da solução-mãe para obter concentrações que variam entre 2 μg/ml e 2 ng/ml. Distribuir 50 μl de cada concentração em poços individuais de uma microplaca de 96 poços com paredes e fundo pretos (ver quadro de Materiais).
- Dilua o reagente de quantificação de dsDNA 1:200 em tampão 1x TE e adicione 55 μl do reagente diluído a cada amostra na microplaca de 96 poços. Misture bem com um agitador de placas e incube por 2 a 5 min em temperatura ambiente, no escuro.
- Meça a fluorescência das amostras usando um leitor de microplacas de fluorescência e filtros para comprimentos de onda de fluoresceína padrão (excitação ~ 480 nm, emissão ~ 520 nm).
- Representar graficamente o intervalo de concentração do plasmídeo em relação às leituras da intensidade de fluorescência.
- Quantificação da suspensão bacteriana:
- Dispense 5 μl de Triton X-100 a 10% por poço em uma microplaca de 96 poços com paredes e fundo pretos (consulte a Tabela de Materiais). Adicionar 50 μl das suspensões bacterianas a cada poço e incubar durante 10 min à temperatura ambiente, num agitador de placas.
- Dilua o reagente de quantificação de dsDNA 1:200 em tampão 1x TE e adicione 55 μl do reagente diluído a cada amostra na microplaca de 96 poços. Misture bem com um agitador de placas e incube por 2 a 5 min em temperatura ambiente, no escuro.
- Meça a fluorescência das amostras usando um leitor de microplacas de fluorescência e filtros para comprimentos de onda de fluoresceína padrão (excitação ~ 480 nm, emissão ~ 520 nm).
- Para obter a concentração de ADN bacteriano, representar graficamente as leituras de fluorescência no gráfico obtido no ponto 1.5.1.4. Divida a concentração de DNA pela massa do genoma da Coxiella (2,2 fg) para obter as concentrações bacterianas. Expresse os resultados em Genoma Equivalente/ml.
- Descarte os mutantes que exibem um defeito de crescimento significativo no ACCM-2.
2. Reação em cadeia da polimerase (PCR) de colônia de primer único, sequenciamento e anotação
NOTA: O protocolo a seguir é para a amplificação de DNA de 96 amostras, uma pipeta multicanal é recomendada para as etapas a seguir. A purificação em coluna de produtos de PCR usando esferas magnéticas e sequenciamento de DNA com um primer específico para transposon (2.3) é subcontratada a uma empresa externa.
- Certifique-se de que o primer de amplificação seja projetado para hibridizar entre 100 e 200 pares de bases a montante da repetição em tandem invertida (ITR), para obter produtos de PCR cobrindo o local de inserção do transposon no genoma da Coxiella. Prepare 3 ml de mistura de PCR (1x tampão de alta fidelidade, 200 μM de trifosfato de desoxinucleosídeo (dNTPs), primer de amplificação de 1 μM, 20 U/ml de DNA polimerase de alta fidelidade) e dispense 29 μl por poço em uma placa de PCR de 96 poços colocada em gelo. Transferir 1 μl de cada mutante na fase estacionária em ACCM-2 para a mistura de PCR.
- Execute PCR com desnaturação inicial (98 °C, 1 min), 20 ciclos de alta rigidez (98 °C, 10 seg; 50 °C, 30 seg; 72 °C, 90 seg), 30 ciclos de baixa rigidez (98 °C, 10 seg; 30 °C, 30 seg; 72 °C, 90 seg) e 30 ciclos de alta rigidez (98 °C, 10seg; 50 °C, 30 seg; 72 °C, 90 seg) seguido de uma extensão final a 72 °C por 7 min.
- Purifique os produtos de PCR usando esferas magnéticas e sequenciar o DNA com um primer específico para transposons. Conceber o primário específico para transposões com uma temperatura de fusão prevista compreendida entre 50 °C e 75 °C, um teor de GC entre 40 % e 60 %, um comprimento entre 18 e 25 nucleótidos e um local de recozimento a jusante do local de hibridização do iniciador de amplificação e pelo menos 100 pares de bases a montante do primeiro par de bases do ITR do transposão.
- Usando o software de análise de sequência, carregue o genoma completo e anotado de Coxiella burnetii 493 NMI. Use a função "alinhar à referência" para carregar e alinhar (blastn) os resultados do sequenciamento e determinar o local de transposição. Descarte mutantes com leituras duplas não correspondentes e/ou exibidas. Para monitorar a saturação da biblioteca mutante, mantenha um registro da ocorrência de várias inserções de transposons no mesmo local.
3. Desafio de células eucarióticas com mutantes de Coxiella e monitoramento do crescimento intracelular
NOTA: Uma pipeta multicanal é recomendada para as etapas a seguir. As infecções foram realizadas em triplicatas em microplacas estéreis de 96 poços com paredes pretas e fundos transparentes planos. wt Coxiella burnetii expressando GFP foi fornecido pelo Dr. Robert Heinzen.
- Cultive células Vero em RPMI sem vermelho de fenol suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) na ausência de antibióticos (meio RPMI completo).
- No dia anterior à infecção, lave as células Vero de um frasco de cultura de células confluente ou subconfluente com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Separar as células Vero adicionando 1 ml de solução de tripsina EDTA ao balão de cultura de células e incubar durante 3 a 5 min a 37 °C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2.
- Ressuspenda as células em 10 ml de meio RPMI completo. Contar as células e preparar uma suspensão celular de 105 células por ml.
- Dispensar 100 μl da suspensão celular em cada alvéolo de uma placa preta de 96 poços com fundo plano e transparente.
- Centrifugue durante 5 min a 400 x g à temperatura ambiente (RT) para facilitar a adesão das células no fundo dos alvéolos e incubar durante a noite a 37 °C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2.
- Descongelar as placas de 96 poços contendo os mutantes de Coxiella em RT e diluir 150 μl de suspensão bacteriana em 300 μl de RPMI sem vermelho de fenol e FBS em uma placa de 96 poços profundos.
- Remover o meio da microplaca contendo células Vero e dispensar 100 μl/alvéolo de mutantes de Coxiella diluídos (MOI de 100). Use o poço A1 como controle negativo (células não infectadas) e os poços A2 e A3 como controles positivos (células infectadas com Coxiella wt expressando GFP em multiplicidades de infecções (MOI) de 100 e 200).
- Centrifugue a placa por 10 min a 400 x g em RT usando um suporte de placa de centrífuga à prova de aerossol.
- Incubar a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 por 2 horas e, em seguida, substituir o meio contendo bactérias por 100 μl/alvéolo de meio RPMI fresco e completo.
- Meça a fluorescência GFP todos os dias durante 7 dias usando um leitor de microplacas de fluorescência e filtros para comprimentos de onda de fluoresceína padrão (excitação ~ 480 nm, emissão ~ 520 nm). Para evitar interferência devido à condensação e dispersão de sinal no meio de cultura, use excitação inferior e registro de emissão no leitor de microplacas.
4. Preparação de amostras para aquisição automatizada de imagens
NOTA: O procedimento é para uma placa de 96 poços, aumente os volumes de acordo. As etapas do 4.2 podem tirar proveito de uma lavadora de placas.
- No7º dia após a infecção, remova o meio da placa e substitua-o por 50 μl/poço de meio fresco e completo contendo um corante fluorescente permeável às células na diluição apropriada (geralmente 1:1.000, a ser otimizado de acordo com a linhagem celular usada). Incube as células por 30 a 60 min a 37 ° C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2.
- Substitua o meio por 50 μl/alvéolo de paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS, incube por 30 min à temperatura ambiente (RT), remova o tampão contendo PFA e lave 3 vezes com PBS.
- Remova o PBS e dispense 50 μl / poço de solução de bloqueio (0,5% de albumina de soro bovino, 50 mM de cloreto de amônio, NH4Cl em PBS, pH 7,4) suplementado com saponina a 0,05%. Incubar em RT por 30 min.
- Substitua a solução de bloqueio por 40 μl/alvéolo de solução de bloqueio fresca suplementada com saponina (como acima) e por um anticorpo antiglicoproteína-1 de membrana associado ao lisossomo (anti-LAMP1) a uma diluição de 1:500. Incubar a placa por 30 min em RT.
- Remova a solução de bloqueio e lave a placa de 96 poços 5 vezes com 100 μl/poço de PBS.
- Dispense 40 μl/alvéolo de solução de bloqueio suplementada com saponina (como acima), o anticorpo secundário marcado com fluorescência apropriado (a uma diluição de 1:1.000) para revelar o anticorpo anti-LAMP1 aplicado na etapa 4.4 e com Hoechst 33258 a 5 μg/ml. Incubar a placa por 30 min em RT.
- Remova a solução de bloqueio e lave a placa de 96 poços 5 vezes com 100 μl/poço de PBS. Deixe o volume de PBS correspondente à última lavagem na placa de 96 poços, pois as células fixas não devem secar.
- Fotografe a placa imediatamente ou armazene-a a 4 °C, protegida da luz, para análise posterior.
5. Aquisição de imagem
- Adquira imagens nos canais GFP (488 nm, bactérias), Hoechst 33258 (350 nm, núcleos de células hospedeiras), vermelho (~555 nm, marcador de membrana celular) e vermelho distante (~615 nm, LAMP1) usando um microscópio automatizado de epifluorescência equipado com uma objetiva de 20X. Adquira 21 campos independentes por poço para obter imagens de um mínimo de 5.000 células por amostra. Aplique o foco automático usando o canal de núcleos da célula hospedeira como referência. Ao trabalhar com patógenos bacterianos que infectam uma baixa porcentagem de células hospedeiras, os usuários podem ajustar o número de campos independentes fotografados por poço, a fim de obter um mínimo de 500 células infectadas para analisar.
