Os protocolos a seguir descreverão métodos para cultura e estudo da invasão pela espécie anaeróbica, P. gingivalis; no entanto, esses protocolos podem ser usados para vários patógenos anaeróbios. Embora as HUVECs sejam usadas, este protocolo pode ser usado para outras células eucarióticas, imunes e não imunes.
1. Uso e manutenção da câmara anaeróbica
Nota: P. gingivalis é um anaeróbio sensível aos níveis normais de oxigênio encontrados no ar ambiente. Um ambiente anaeróbico controlado é vital para o cultivo de P. gingivalis.
- Aqui, manter uma atmosfera artificial designada como gás anaeróbio misto (80% N2, 10% H2, 10% CO2) em uma câmara anaeróbica de vinil (Figura 1A). Use uma câmara de ar (Figura 1B) para transferir itens do ambiente de laboratório para a câmara anaeróbica. A câmara de ar opera manualmente, purgando duas vezes com gás N2 antes de introduzir o gás anaeróbico misto.
- Use uma coluna de remoção de sulfeto de hidrogênio (Figura 1C) para remoção livre de manutenção do sulfeto de hidrogênio indesejável. Coloque um desumidificador dentro da câmara para remover o H2O criado pelo catalisador e evitar aerossóis que facilitem a propagação da contaminação.
nota: O sulfeto de hidrogênio é um subproduto metabólico natural de muitas bactérias anaeróbicas e seu acúmulo é tóxico para as bactérias e pode resultar em danos aos componentes eletrônicos e diminuir a vida útil de um catalisador.
- Use uma caixa de ventilador para circular a atmosfera da câmara através de um catalisador de paládio, que remove o oxigênio na presença de hidrogênio (Figura 1D).
Nota: Um filtro atmosférico de recirculação (ar particulado de alta eficiência ou HEPA) remove contaminantes transportados pelo ar com um tamanho de 0,22 μm ou maior.
- Cultivar bactérias anaeróbias numa incubadora a 37 °C localizada no interior da câmara anaeróbia. Use técnicas assépticas padrão ao trabalhar dentro da câmara anaeróbica.
2. Preparação de bactérias anaeróbicas
Nota: P. gingivalis é aerotolerante e pode ser armazenado em condições aeróbicas, mas não crescerá na presença de oxigênio em níveis superiores a 6%. Uma câmara anaeróbica é necessária para o cultivo adequado de P. gingivalis e outras espécies anaeróbias (Figura 1). Treinamento e educação adequados sobre o uso de câmaras anaeróbicas são necessários antes de trabalhar com microanaeróbios.
- Equilibre todos os meios líquidos e placas em condições anaeróbicas por pelo menos 12 horas antes da experimentação para remover o oxigênio residual.
- Transfira P. gingivalis de um freezer a -80 ° C para uma câmara anaeróbica e deixe descongelar.
- Estriar P. gingivalis em placas de ágar sangue tripticase soja (TSA II com 5% de sangue de ovelha). Embrulhar as placas em parafilme e armazenar a 37 °C em uma incubadora anaeróbica por 4-7 dias.
- Inocular P. gingivalis em 3 ml de caldo de infusão cérebro-coração (BHI) suplementado com hemina e menadiona, um meio líquido não seletivo enriquecido para o isolamento e cultura de microrganismos anaeróbios e fastidiosos, utilizando alças estéreis.
nota: Para armazenamento de longo prazo, misture culturas bacterianas preparadas em BHI com glicerol ou DMSO (concentração final de 10-20%) e coloque em um freezer a -80 °C.
- Prepare uma cultura inicial de P. gingivalis fazendo uma diluição de 1:10 e permitindo que as bactérias cresçam até a fase intermediária.
Nota: A densidade óptica da suspensão bacteriana é determinada e a concentração bacteriana para cada cepa a ser examinada é ajustada. Para P. gingivalis, uma suspensão em OD660 de 0,7 corresponde à fase mid-log e ~7 x 108 células/ml. As condições de crescimento descritas no protocolo acima são específicas para P. gingivalis e podem precisar ser adaptadas para outras cepas bacterianas.
3. Cultura de células endoteliais
Nota: Compre HUVECs primários agrupados e cultura em meio basal contendo fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) a 37 °C em 5% de CO2 de acordo com as instruções do fabricante.
- Semear HUVECs em frascos T-75 a 2,5 x 105 células/frasco em meio VEGF de 15 ml.
nota: Verifique a viabilidade através de uma diluição de 1:1 com 4,0% de azul de tripano. As células com uma membrana comprometida reterão o azul de tripano, e as células saudáveis com membranas intactas parecerão brancas quando vistas sob um microscópio óptico binocular. Conte 100 células e certifique-se de que mais de 80% das células sejam viáveis.
- Substitua o meio a cada 2 dias por meio de VEGF fresco pré-aquecido até que as células atinjam ~ 80% de confluência.
- Lave as células uma vez com solução salina tamponada com fosfato pré-aquecido (PBS). Libere as células do frasco T75 incubando com 2 ml de tripsina-EDTA (0,25%) por 5 min, seguido de 2 ml de solução neutralizante de tripsina.
- Colete HUVECs suspensos em um tubo cônico de 50 ml. Lave as células extras dos frascos T-75 com PBS e transfira para tubos cônicos de 50 ml.
- Centrifugue as células a 200 x g por 10 min.
- Remova o sobrenadante e suspenda o pellet celular em 10 ml de meio VEGF pré-aquecido.
- Determine a concentração celular usando um hemocitômetro ou dispositivo semelhante de contagem de células.
- Calcule a quantidade de suspensão de células a ser adicionada a uma placa de 6 poços (400.000/poço) ou a uma placa de 12 poços com lamínulas (50.000/poço). Os HUVECs estarão prontos para experimentação no dia seguinte.
4. Invasão/Interação do Ensaio de Sobrevivência (Plating)
Nota: Ao realizar este ensaio, prepare duas placas de 6 poços de células endoteliais semeadas a 400.000 células/poço. Uma placa será usada para avaliar as bactérias ligadas e internalizadas pelas células hospedeiras. A outra placa será responsável por bactérias intracelulares. A placa de 6 poços permite que triplicados de duas amostras sejam realizados em um experimento. Para obter um esboço deste protocolo, consulte o fluxograma do ensaio de sobrevivência (Figura 2).
- Prepare as bactérias anaeróbicas conforme descrito acima (ver seção 1) até que atinjam o crescimento médio (OD660 0,5-0,7).
- Centrifugue bactérias a 5.000 x g por 10 min.
Nota: Se a centrífuga estiver fora de uma câmara anaeróbica, transporte amostras bacterianas em um tubo hermeticamente fechado de 15 ml e envolva a tampa com parafilme para evitar vazamento de oxigênio.
- Coloque P. gingivalis peletizado de volta na câmara e descarte o sobrenadante. Lave com PBS e pellet bactérias novamente antes de ressuspender em meio VEGF. Preparar suspensões para todas as estirpes bacterianas a testar a OD660 de 0,7, que corresponde à fase intermédia (~7 x 10,8 células/ml). A bactéria agora está pronta para a infecção.
- Transfira placas de 6 poços contendo HUVECs da incubadora de cultura de tecidos para a câmara anaeróbica. Remova o meio e lave três vezes com PBS anaeróbico. Adicione 2 ml de meio anaeróbio de VEGF a cada poço e coloque as placas a 37 °C na incubadora anaeróbia por 20 min para equilibrar a temperatura de infecção.
nota: Placas de bactérias em placas de ágar sangue para garantir que as usadas para infecção sejam homogêneas e não contaminadas após a infecção.
- Infectar células hospedeiras com bactérias em uma multiplicidade de infecção (bactérias MOI: hospedeiro) de 100:1.
nota: O número de células HUVEC é determinado pela realização de um teste de exclusão de tripano em um único poço antes da infecção. O número de células bacterianas é determinado por meio da densidade óptica (por exemplo, OD de 0,5 = 5 x 108 células/ml). A concentração bacteriana é ajustada para MOI adequado com base na concentração de HUVEC.
- Coloque placas de 6 poços com HUVECs infectados na incubadora anaeróbica e permita que as bactérias interajam com as células hospedeiras por 30 minutos.
- Preparar saponina em BHI (1,0% p/v) dentro da câmara anaeróbia e filtrar através de um filtro de 0,2 μm.
- Sobrevivência de bactérias ligadas e internalizadas.
- Remova as placas da incubadora, aspire o meio, lave três vezes com PBS anaeróbico e adicione 2 ml de saponina filtrada a 1,0% (preparada conforme descrito na etapa 4.8). Incube por 15 min para permitir a lise da célula hospedeira.
- Raspe o fundo de cada poço com um raspador de células. Coletar a mistura de células de cada poço e fazer uma diluição de 1:1 em BHI.
- Proceder a diluições em série da amostra. Dependendo da espécie bacteriana e da concentração, ajuste as diluições em série. Comece com diluições de 1:100 ou 1:1.000.
- Placa 200 μl da diluição desejada em placas de ágar sangue. Embrulhar as placas em parafilme e colocá-las na incubadora anaeróbia a 37 °C.
- Após sete dias de incubação a 37 °C, remover as placas e contar as unidades formadoras de colônias (UFCs) usando uma caixa de luz para contar manualmente as colônias.
nota: As UFC são enumeradas. Para quantidades maiores de UFC, podem ser obtidas imagens e pode ser utilizado software informático para facilitar a enumeração das UFC.
