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1. Internalização de Bactérias em Células Hospedeiras (Microscopia Fluorescente)
Nota: P. gingivalis é rotulado com 2',7'-Bis-(2-Carboxietil)-5-(e-6)-Carboxifluoresceína, Éster Acetoximetílico (BCECF-AM). BCECF-AM é um corante permeável à membrana não fluorescente; sua conversão em fluoresceína BCECF via ação de esterases intracelulares pode indicar viabilidade celular. P. gingivalis é marcado com o corante BCECF-AM e então usado para infectar células eucarióticas. Após a infecção, as células são fixadas e marcadas com DAPI e TRITC-faloidina. A coloração DAPI usada para corar o núcleo da célula eucariótica também rotulará o núcleo da célula bacteriana, o que fornece uma contramedida para identificar bactérias não viáveis que não podem clivar metabolicamente o BCECF-AM. As células hospedeiras são destacadas com TRITC-faloidina, um corante vermelho de actina.
- Lamínulas em autoclave. Adicione assepticamente lamínulas a placas de 12 poços antes de semear células endoteliais a 5 x 104 células/poço. (Preparado um dia antes do experimento)
- Preparar células endoteliais em lamínulas circulares de 18 mm (# 1,5 espessura) em placas de 12 poços, conforme descrito acima.
- Prepare bactérias anaeróbicas cultivadas até a fase intermediária (OD660 = 0,5-0,7).
- Lave as bactérias 2x com PBS anaeróbico centrifugando a 5.000 x g e suspendendo o pellet em PBS a 5-7 x 108 células / ml.
- Adicionar 20 μl de 0,2 mM DE BCECF-AM a 2 ml de suspensão bacteriana (5-7 x 108 células/ml) a uma concentração final de BCECF-AM de 2 μM.
- Incubar a 37 °C durante 30 min no escuro.
- Placas de transferência com células endoteliais semeadas em lamínulas circulares de 18 mm (espessura # 1,5) da incubadora de cultura de tecidos para a câmara anaeróbica. Lavar com PBS e trocar com meio anaeróbio VEGF.
Nota: Verifique se os HUVECs estão saudáveis sob um microscópio óptico. HUVECS deve ser ~ 80% confluente, a morfologia deve ser comparável aos fabricantes.
- Centrifugue bactérias marcadas a 5.000 x g por 10 min para remover o corante BCECF-AM residual. Suspender em meio anaeróbio de VEGF de 2 ml.
- Infecte as células hospedeiras com bactérias marcadas no MOI de 100: 1 (bactéria: hospedeiro).
- Incubar numa câmara anaeróbia a 37 °C durante 30 min.
- Após a infecção, lave as células com PBS três vezes e fixe em paraformaldeído a 4,0% recém-preparado por 10 min.
nota: Após a fixação das células, os experimentos podem ser conduzidos fora da câmara anaeróbica.
- Lave as lamínulas com PBS três vezes.
- Adicione 1 ml de Triton X-100 a 0,2% por 10 min.
- Lave as lamínulas com PBS três vezes.
- Adicione 50 μl de faloidina TRITC (50 μg/ml) às lamínulas durante 45 min.
- Lave as lamínulas três vezes, remova-as da placa de 12 poços e coloque-as em uma lâmina com um meio de montagem macio contendo DAPI. Sele as laterais com esmalte.
nota: As lâminas podem ser armazenadas por alguns meses no escuro. Evite a exposição à luz para evitar o fotobranqueamento.
- Visualize as lâminas usando um microscópio confocal.
- Aqui, use um sistema espectral de 34 canais (detector de matriz de 32 canais e dois detectores PMT laterais, além de um detector de luz transmitida) configurado em torno de um suporte AxioObserver (invertido) com um estágio XY motorizado. O sistema possui cinco lasers: diodo azul (405 nm), argônio multilinha (458, 488, 514 nm), diodo verde (561 nm), HeNe vermelho (633 nm) e um laser pulsado de 440 nm. Equipe um sistema de imagem de fluorescência vitalícia com 2 detectores híbridos de GaAsP (para FRET-FLIM).
- Detectar a fluorescência de DAPI e TRITC em um canal usando um filtro de banda dupla com comprimentos de onda de excitação de 340-380 nm e 540-560 nm, e um filtro de emissão de 435-485 nm e 570-590 nm, respectivamente. Detectar a fluorescência do BCECF-AM usando um filtro com comprimento de onda de excitação de 440-500 nm e um filtro de emissão de 510-590 nm.
nota: Os controles para BCECF-AM devem ser feitos em todas as cepas bacterianas em estudo para garantir a rotulagem adequada de bactérias viáveis. Primeiro, valide que as bactérias não viáveis são DAPI-positivas e BCECF-negativas. Em segundo lugar, certifique-se de que as bactérias vivas possam metabolizar BCECF-AM em fluoresceína BCECF. Concentrações variáveis da bactéria ou do corante BCECF-AM podem precisar ser testadas para uma rotulagem ideal.