1. Cultura, diferenciação e validação de células HL-60
- Prepare meios de cultura de células HL-60 compostos por 500 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com L-glutamina e 50 mL de soro fetal bovino inativado por calor. Não adicione antibióticos, pois isso pode afetar a diferenciação das células HL-60.
- Para propagação/manutenção de células HL-60, cultivar 5 x 106 células em 10 ml de meios de cultura de células HL-60 em frascos ventilados de 75 cm2 a 37 °C e 5% de dióxido de carbono (CO2). Células de passagem a cada 3-4 dias para manter as concentrações celulares ideais.
nota: A concentração da célula não deve exceder 5 x 106 / mL.
- Gerar estoques de trabalho de células HL-60 aliquotando aproximadamente 1 x 106 células/mL em meios de cultura HL60 com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) em tubos criogênicos de 1 mL.
nota: As existências de exploração podem ser armazenadas a -80 °C. O estoque principal deve ser armazenado a -120 °C.
- Diferencie as células HL-60 cultivando 1,5 x 107 células em 15 mL de meio de cultura de células HL-60 com 0,6% de N, N-dimetilformamida (DMF) a 37 ° C e 5% de CO2 em frascos estéreis de 75 cm2 com tampa de filtro por 3 dias antes da atividade de morte opsonofagocítica (OPKA).
- Validar se as células HL-60 foram diferenciadas com sucesso e são apropriadas para uso no ensaio OPKA, testando a viabilidade e os marcadores de superfície celular de acordo com os protocolos de citometria de fluxo estabelecidos. Após a diferenciação, colha as células HL-60 e cove aproximadamente 1 x 104 células com anticorpos/corantes conjugados com fluorescência para CD71, CD35, anexina V e iodeto de propídio.
nota: As células diferenciadas devem ser ≥65% viáveis, ≥55% CD35+ e ≤20% CD71+, conforme determinado por meio de protocolos de validação estabelecidos (Figura 1).
2. Preparação de tampões e reagentes OPKA
- Prepare 50 mL de tampão de opsonização estéril B (OBB) misturando 42,5 mL de solução salina estéril 1x tamponada com fosfato (PBS) com Ca2+/Mg2+, 5 mL de soro fetal bovino inativado pelo calor e 2,5 mL de gelatina estéril a 0,1%. Conservar a 4 °C.
- Obtenha complemento para coelhos bebês e armazene a -80 °C.
- Obtenha ou prepare placas de cultura bacteriana (ou seja, placas de ágar sangue de ovelha de 15 x 100 mma 2 a 5%).
3. Preparação de Amostras de Estoque de Bactérias
- Obter um estoque da(s) cepa(s) bacteriana(s) a ser testada.
NOTA: Para este protocolo, o sorotipo 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, generosamente fornecido pelo Dr. Moon Nahm) é usado.
- Cultive a cepa bacteriana em um caldo apropriado (ou seja, caldo Todd-Hewitt + 0,5% de extrato de levedura para esta cepa WU2) por aproximadamente 2−4 h a 37 °C.
nota: A densidade óptica a 600 nm (OD600) da cultura deve estar entre 0,6 e 0,8.
- Pulverize as bactérias por centrifugação a 6.000 x g por 2 min e ressuspenda as células em 10-30 mL de glicerol a 15% no caldo apropriado. Aliquotar a cultura bacteriana (500 μL por alíquota) em tubos de centrífuga estéreis de 1,5 ml e conservá-la a -80 °C.
- Descongelar um frasco para injetáveis de caldo bacteriano num banho-maria a 37 °C. Pulverize as células bacterianas e ressuspenda em 500 μL de OBB em condições estéreis.
- Preparar diferentes diluições do stock bacteriano em OBB (ou seja, 10 μL sem diluição, 10 μL de 1:10, 10 μL de 1:100, etc.). Realize o ensaio OPKA (seções 4-6, incluindo HL-60 / co-cultura de complemento) conforme descrito abaixo, usando várias diluições do estoque bacteriano não tratado. Cultivar as placas durante a noite a 30 °C (sem CO2).
nota: A temperatura de 30 °C é específica para WU2 para evitar o crescimento excessivo; outras cepas/sorotipos podem crescer de forma ideal a 37 °C.
- Contar as colónias para cada diluição de massa bacteriana não tratada co-cultivada com células HL-60 e complemento. Determine qual diluição de bactérias produz o número ideal de colônias contáveis (aproximadamente 80-120 unidades formadoras de colônias (UFCs) para bactérias não tratadas co-cultivadas com células HL-60). Observe esta diluição para futuros OPKAs envolvendo esse estoque bacteriano.
4. Tratamento e cultura bacteriana
- Descongele um tubo de estoque bacteriano preparado na etapa 3.3. Sedimentar bactérias (6.000 x g durante 2 min) e ressuspender o sedimento celular em OBB com diluição ótima, conforme determinado no passo 3.6.
- Pipetar 10 μL de diluição bacteriana ressuspensa por alvéolo numa placa de cultura de células de fundo redondo de 96 poços.
- Adicione 20 μL de tratamento adequado com anticorpos ou medicamentos a cada poço experimental em duplicata.
NOTA: Neste protocolo, um anticorpo específico do sorotipo gerado em camundongos é adicionado como tratamento X, e uma enzima glicosídeo hidrolase conhecida por degradar a cápsula polissacarídica do sorotipo 3 é adicionada como tratamento Y (Figura 2). Para poços de controle, use 1x PBS ou OBB, dependendo do tampão usado para poços de tratamento.
- Agitar a placa de amostra a cerca de 90 rpm durante 1 h à temperatura ambiente. Ajuste essas condições dependendo da temperatura ideal ou das condições de agitação dos tratamentos que estão sendo testados.
5. Co-cultura bacteriana HL-60
- Prepare as células HL-60 colhendo as células diferenciadas HL-60 que são tratadas com DMF três dias antes (consulte a etapa 1.4) em tubos cônicos de 15 mL. Pellet as células (500 x g, 3 min), descarte o sobrenadante e lave com pelo menos 10 mL de 1x PBS.
- Pulverize as células lavadas (500 x g, 3 min), descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em OBB (comece com 1 mL de OBB e ajuste para uma concentração final de 1 x 107 / mL após a contagem de células).
- Adicione complemento para coelhos bebês (soro estéril e não diluído, idade de 3 a 4 semanas) em um volume final de 1:5.
nota: A concentração final da mistura HL-60-complemento deve ser de 1 x 107/ml. Se testar a dependência do complemento, pode ser utilizada uma segunda solução contendo células HL-60 ativas com complemento inativado pelo calor (o complemento pode ser inativado incubando-se em banho-maria a >55 °C durante, pelo menos, 30 min).
- Após a conclusão da cultura bacteriana de 1 h (etapa 4.4), divida cada amostra (ou seja, 10 μL de cada poço de amostra de 30 μL em dois novos poços) em poços duplicados para dois grupos (ou seja, use apenas 20 μL da co-cultura original de 30 μL para contabilizar o erro de pipetagem): um conjunto será co-cultivado com complemento HL-60 e outro incluirá apenas bactérias. Adicionar 50 μL da mistura HL-60-complemento (da etapa 5.3) a cada conjunto experimental de alvéolos (delegado +HL-60); adicionar 50 μL de OBB sozinho aos poços de bactérias apenas (delegado -HL-60).
nota: Para este exemplo, aproximadamente 800 UFCs bacterianas são usadas para a co-cultura inicial com células HL-5 x 105/50 μL. Se essa multiplicidade de infecção for muito alta ou muito baixa, conforme indicado pelo número final de colônias, ajuste a diluição bacteriana inicial em oposição à contagem de células HL-60.
- Agite a placa de 96 poços a 37 °C por 1 h (sem CO2).
6. Revestimento de amostras e incubação durante a noite
- Diluir cada alvéolo 1:5 com OBB, de modo a que cada amostra tenha um volume de pelo menos 50 μL.
- Pipetar 50 μL de cada amostra diretamente sobre uma área designada de uma placa de cultura bacteriana, garantindo um espaçamento adequado entre as amostras. Para placas de ágar redondas de 15 x 100 mm2, pipetar aproximadamente 4 amostras em uma placa.
- Cubra e deixe as amostras secarem por aproximadamente 15 minutos em temperatura ambiente.
- Inverter as placas e cultivar durante a noite a 30 °C (sem CO2). Alternativamente, placas de cultura em frascos anaeróbicos para testar se as condições anóxicas afetam o crescimento bacteriano ou para controlar a morfologia.
- Após a cultura durante a noite, conte as colônias em cada área de amostra designada. Analise os dados comparando o número de células vivas em cada conjunto com o controle correspondente e/ou amostras que não recebem co-cultura de células HL-60 (indicativo de 100% de sobrevivência celular, 0% de morte celular).
