Avaliação de Porphyromonas gingivalis internalizadas em células endoteliais hospedeiras

Resumo

Fonte: Wunsch, C. M., et al. Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para avaliar a interação de bactérias anaeróbicas com células hospedeiras. J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, demonstramos um ensaio para avaliar a sobrevivência de Porphyromonas gingivalis dentro de células endoteliais humanas. A medida de sobrevivência e crescimento de Porphyromonas gingivalis internalizadas é avaliada pelo número de colônias na placa de ágar sangue.

Protocolo

1. Sobrevivência de bactérias internalizadas.

1. Prepare as bactérias anaeróbicas P. gingivalis até que atinjam o crescimento do meio do log (OD₆₆₀ 0,5-0,7).
2. Centrifugue bactérias a 5.000 x g por 10 min.
3. Coloque P. gingivalis peletizado de volta na câmara e descarte o sobrenadante. Lave com PBS e pellet bactérias novamente antes de ressuspender em meio VEGF. Preparar suspensões para todas as estirpes bacterianas a testar a OD₆₆₀ de 0,7, que corresponde à fase intermédia (~7 x 10,⁸ células/ml). A bactéria agora está pronta para a infecção.
4. Transfira placas de 6 poços contendo HUVECs da incubadora de cultura de tecidos para a câmara anaeróbica. Remova o meio e lave três vezes com PBS anaeróbico. Adicionar 2 ml de meio anaeróbio de VEGF a cada alvéolo e colocar as placas a 37 °C na incubadora anaeróbia durante 20 minutos para equilibrar a temperatura de infecção.
5. Infectar células hospedeiras com bactérias em uma multiplicidade de infecção (bactérias MOI: hospedeiro) de 100:1.
   nota: O número de células HUVEC é determinado pela realização de um teste de exclusão de tripano em um único poço antes da infecção. O número de células bacterianas é determinado por meio da densidade óptica (por exemplo, OD de 0,5 = 5 x 10⁸ células/ml). A concentração bacteriana é ajustada para MOI adequado com base na concentração de HUVEC.
6. Coloque placas de 6 poços com HUVECs infectados em uma incubadora anaeróbica e permita que as bactérias interajam com as células hospedeiras por 30 min.
7. Preparar saponina em BHI (1,0% p/v) dentro da câmara anaeróbia e filtrar através de um filtro de 0,2 μm.
8. Remova as placas da incubadora. Lave três vezes com PBS anaeróbico e adicione 2 ml de meio VEGF com antibiótico suplementado (300 μg/ml de gentamicina e 400 μg/ml de metronidazol).
9. Incube por 1 hora. Certifique-se de testar os antibióticos para que eles sejam 100% eficazes em matar a cepa bacteriana desejada e certifique-se de que eles não penetrem nas células hospedeiras.
10. Aspire o meio, adicione 2 ml de saponina filtrada a 1,0%. Incube por 15 min para permitir a lise da célula hospedeira.
11. Raspe o fundo de cada poço com um raspador de células. Coletar a mistura de células de cada poço e fazer uma diluição de 1:1 em BHI.
12. Prepare diluições seriadas da amostra (1:100, 1:1.000).
13. Placa 200 μl da diluição desejada em placas de ágar sangue. Embrulhe as placas em parafilme e coloque-as em uma incubadora anaeróbica.
14. Após sete dias de incubação a 37 °C, remover as placas e contar as UFC.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Câmara Anaeróbica de Vinil-Tipo B	Produtos de laboratório Coy		Incubadora modelo 2000
Ágar de soja tripticase TSA II com 5% de sangue de ovelha	Bbl	221261
Células endoteliais da veia umbilical humana 10 doadores	Tecnologia LifeLine	FC-0044
Kit Completo VascuLife VEGF Médio	Tecnologia LifeLine	LL-0003
TrypKit	Salvação	LL-0013
saponina	Riedel-de Haen	Rolamento 16109
Sal de sulfato de gentamicina	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazol	Sigma-Aldrich	M-3761